张莉++李现道++张国超++杜传印++孟庆洪++刘春菊++于金凤+刘爱新

摘要：为了解易脆毛霉多糖的抗病促生效果，本研究采用盆栽试验和半叶枯斑法测定了该多糖处理对烟苗生长的影响及TMV的抗性。结果表明，多糖处理对烟苗有明显的促生作用，多糖处理烟苗最大叶面积、地上部鲜重、根部鲜重、总叶绿素含量和光合速率均显著增加；多糖处理对TMV的预防效果最好，可达62%，钝化效果次之，治疗效果相对较差，均低于40%。表明，易脆毛霉多糖不仅可以促进烟苗生长，而且对TMV有较好的预防作用，可为今后开发利用该真菌多糖提供参考。

关键词：易脆毛霉多糖；促生作用；烟草花叶病毒；抑制作用

中圖分类号：S572.01文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）02-0127-05

真菌多糖是一类天然高分子化合物，广泛存在于真菌特别是大型真菌的细胞壁中，因其具有抗肿瘤、抗病毒[1]和免疫调节[2]等作用而被医药界广泛关注。真菌多糖为β型多糖，常见的有几丁聚糖、氨基寡糖素、菇类蛋白多糖等，许多研究表明，这类多糖不仅具有抑杀真菌、细菌和病毒的作用，而且能够调节作物生长，诱导植物产生抗性[3]。作为天然化合物，真菌多糖还具有无毒、易被降解、对环境无污染等特性，使其有可能作为一种新型植物抗病诱导剂在农业生产中发挥重要作用[4]。

病毒病是烟叶生产中最重要的病害之一，常见烟草病毒病包括马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）等。国内外对烟草病毒病防治做了大量研究，并取得了一些进展[5-7]，但生产上仍缺乏对烟草病毒病的有效控制措施。真菌多糖作为一种新型抗病毒物质越来越受重视，吴艳兵等[8]和罗琰[9]分别研究了毛头鬼伞多糖和香菇多糖的抗病毒作用，发现两种多糖对TMV均有较强的抑制作用。本研究从一株易脆毛霉中提取多糖粗提物，分析该多糖处理对烟苗生长的影响及TMV的室内抑制作用，为易脆毛霉多糖的进一步应用提供参考。

1材料与方法

1.1材料

菌株材料：易脆毛霉（Mucor fuagilis）菌株DBJ-1，由山东农业大学分子植物病理学实验室保存；TMV病毒，由山东农业大学刘红梅老师提供。

供试烟草品种：烟草品种K326，用于促生作用分析；三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN），用于TMV抗性分析。

培养基：易脆毛霉培养用PDA培养基；DBJ-1发酵培养用液体培养基，具体配比参照牛小义[4]的方法，组成成分包括冷榨豆饼粉1%，蛋白胨0.2%，葡萄糖3%，MgSO4 0.05%，KH2PO4 0.10%，维生素B1 0.01%，调节pH至5.5。

1.2方法

1.2.1多糖提取将DBJ-1接种于PDA培养基，置于28℃恒温箱中培养6～7 d，挑取一环于发酵培养基中，28℃、220 r/min培养7 d，5 000 r/min离心10 min收集菌丝体，无菌水充分洗涤。菌丝体于65℃烘箱烘至恒重，干菌丝在研钵中研细，过80目筛制成干粉。菌丝体干粉加40倍水，80℃水浴浸提2 h，重复两次，合并两次提取液，浓缩至原体积的1/15，缓慢加入3倍体积的95%乙醇，4℃静置过夜，8 000 r/min离心10 min，留取沉淀，沉淀相继以95%乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得到多糖。

1.2.2多糖含量测定 ① 葡萄糖标准曲线的建立。参照陶美华等[10]的方法 ，准确称取葡萄糖100 mg，用无菌水制成1 mg/mL标准液，备用。分别吸取葡萄糖标准液采用倍比稀释法配置成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL的葡萄糖溶液。取上述溶液各0.4 mL，加入5%重蒸苯酚0.8 mL，混匀，迅速加入浓硫酸 4 mL，沸水浴加热15 min后，冷却至室温，于490 nm处测定吸光度。以水代替葡萄糖液为空白对照。根据糖浓度及吸光度值绘制回归方程。

②多糖含量的测定。精密称取多糖粉末50 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按照上述方法，测定吸光度，平行测定3次，得到3个样品的多糖含量，计算平均值。

1.2.3多糖对烟苗的促生作用分析分别配制浓度为0.65 mg/mL和1.30 mg/mL的多糖溶液，选择长势一致的4～5叶期的烟草K326幼苗，将上述多糖溶液均匀喷施于烟叶表面，连续处理3次，每次间隔7 d，于最后一次处理7 d后，检测叶片叶绿素含量、最大叶面积、鲜重等，每处理10 株烟苗。以清水同样处理为对照。

1.2.4多糖对烟苗光合作用的影响采用1.2.3的方法处理烟苗，于最后一次处理后7 d测定烟苗的光合速率、蒸腾速率、气孔导度及胞间CO2浓度，每处理10 株烟苗。以清水同样处理为对照。

1.2.5多糖对TMV的抑制作用三生烟烟苗温室内培养至5～6叶期，采用半叶法从3个方面分析多糖对烟草花叶病毒病的抗病效果。

①多糖对TMV的预防作用。选取长势一致的烟苗，按1.2.3中的浓度配置多糖溶液，分别喷施到待测叶片右半叶，左半叶喷清水为对照，间隔7 d再喷一次，于第二次喷雾后2 d，采用摩擦接种法将20 μL TMV病毒汁液均匀涂抹到整个叶片，每株处理 3 片叶，每处理重复 3 次。

②多糖对TMV的治疗作用。采用上述类似方法进行处理，所不同的是，在烟苗叶片接种TMV病毒汁液后1 d，喷多糖溶液于右半叶，以左半叶喷清水为对照。每株处理 3 片叶，每处理重复 3 次。

③多糖对TMV的钝化作用。首先取上述配制好的多糖溶液与TMV病毒汁液按1∶1 的比例混匀，室温下静置30 min，将钝化处理的病毒汁液摩擦接种到三生烟右半叶，左半叶接种用清水处理的病毒汁液为对照。每株处理 3 片叶，每处理重复 3 次。

经上述处理过的烟苗，于25℃、光12 h/暗12 h培养箱中培养2～3 d，统计各处理的枯斑数，计算抑制效果。计算公式如下：

枯斑抑制率（%）=（对照枯斑数-处理枯斑数）/对照枯斑数×100。

2结果与分析

2.1DBJ-1多糖含量测定

以糖浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y），做出葡萄糖标准曲线（图1），可见该曲线基本为一条直线，经计算得回归方程为Y=3.7821X+0.0116， 其中R2=0.9904。由此可知，葡萄糖在0.02～0.14 mg/mL范围内，标准曲线线性良好，利用该方程计算出DBJ-1多糖粗品中的多糖含量为65%。

图1葡萄糖浓度标准曲线

2.2多糖处理对烟苗生長的促生作用

图2为经多糖处理7 d后烟苗的生长状况，可见，经两种浓度的多糖处理，烟苗叶色浓绿，根系较发达。

a：0.65 mg/mL多糖处理；b： 1.30 mg/mL多糖处理；c： 对照。

图2多糖处理对烟草幼苗生长的影响

对烟草叶片最大叶面积、鲜重、总叶绿素含量等进行测定，结果见表1，发现，与对照相比，经浓度0.65 mg/mL 和1.30 mg/mL多糖处理后，烟苗最大叶面积分别增加34.8%和59.0%，地上部鲜重分别增加58.9%和51.8%，根部鲜重分别增加200.0%和166.7%，总叶绿素含量分别增加27.6%和22.0%。差异显著性分析表明，两种浓度处理在最大叶面积、地上部鲜重、根部鲜重和总叶绿素含量等方面均显著高于对照，但两个处理浓度间均差异不显著。

采用半叶枯斑法，从钝化、治疗和预防3个方面分析了多糖处理烟苗对TMV的抗性，结果如表3、图3。可见，经多糖处理后，烟苗对TMV预防效果最好，0.65 mg/mL和 1.30 mg/mL浓度处理枯斑数分别比对照减少13.3个和11.7个，枯斑抑制率分别为52%和62%；多糖对TMV的钝化效果次之，0.65 mg/mL和 1.30 mg/mL浓度处理的枯斑抑制率分别为40%和57%；多糖对TMV的治疗效果相对较差，0.65 mg/mL和 1.30 mg/mL浓度处理治疗效果均低于40%。差异显著性分析表明，两种多糖浓度处理后，对TMV 的抑制效果差异不显著。

3讨论与结论

由于真菌多糖的提取比较复杂，其在植物抗病防卫中的应用目前还相对较少。近年来，利用真菌多糖粗提物防治植物病害的报道越来越多。牛小义等[11]研究发现，云芝多糖不仅能增加烟草对CMV的抗性，而且对烟草生长也有明显的促进作用。其它报道的对植物病毒有抗病作用的多糖还有猴头菇多糖、灰树花多糖、毛头鬼伞和香菇多糖等[4]，这些不同来源的多糖粗提物都显示对病毒病有较好的抑制作用。本研究发现，易脆毛霉多糖粗提物处理烟草后，不仅植株的最大叶面积和鲜重显著增加，而且叶片的叶绿素含量和光合效率都显著增强；枯斑反应测定发现，该多糖对TMV也有很好的抑制作用，预防效果最好，最高可达62%，钝化效果次之，均明显高于治疗效果。表明，易脆毛霉多糖不仅能促进烟草生长，而且能增强烟苗对TMV的抗性。鉴于该多糖良好的抗病促生效果，以及该物质对人畜和环境安全等特征，真菌多糖的应用符合当前生物防治发展的需要，具有良好的开发应用潜力，下一步将进行深入研究。

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收稿日期：2016-07-27