李鑫鑫　邬少飞

【摘 要】数字PCR一般包括两部分。即PCR的扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段。利用数字PCR先将样品稀释到单分子水平[1]，平均到几十到几万个单元中进行化学反应，使得各个反应单元中目标分子是0或者1，使得目标分子阳性信号得以检测。实验会利用上端软件控制实验室其中一台PCR子仪器的运行，对仪器中的数据进行采集，以及对科学采集到的数据进行分析和处理，便于对基因的定量分析和检测。该软件要控制其中一台PCR仪器的运行和工作。另外这台仪器会通过USB接口把采集的数据上传到PC端，通过PC端的软件程序进行分析和处理。最后得出实验结论。

【关键词】数字PCR；荧光检测仪；数据分析；生命科学与计算机；仪器控制

The Software System Design Model Based on Digital PCR Fluorescence Detector

LI Xin-xin WU Shao-fei

（Wuhan Institute of Technology School of computer science and Engineering，Wuhan Hubei 430205，China）

【Abstract】Digital PCR generally includes two parts. That is， the PCR amplification and fluorescence signal analysis. In the PCR amplification stage. Using digital PCR to dilute samples onto a single molecule level[1]， the average to dozens to tens of thousands of units in chemical reaction， make each reaction unit of target molecules is 0 or 1， makes the target molecules positive signal detection. One of them will use the upper software control laboratory PCR instrument operation， instrument of the data acquisition， as well as to the scientific analysis and processing the data collected， is advantageous for the quantitative analysis of the gene and detection. The software to control one PCR instrument operation and work. In addition this instrument will collect data uploaded to PC through USB interface， through analysis and deal with the PC software. Finally experimental conclusions.

【Key words】Digital PCR； Fluorescence detector； Data analysis； Life sciences and computer； Instrument control

0 引言

社會在不断地进步，人们的生活方式在提高，物质条件也在逐步改善，越来越多的人在享受高品质生活的同时，也愈加得关注个人的身体健康。数字PCR这种分子检查技术除了用于疾病的预测及早期诊断外，还将用来指导人们的常规体检，让常规体检更具有针对性，从而改变人们的健康管理的观念。除此之外，它还可以用来指导人们管理疾病，进而指导病人安全用药，可以帮助医生规划针对个体病人的治疗措施，以便人们对疾病的治疗更加有的放矢。

核酸分子的定量最常见的有三种方法；（1）利用核酸分子对光的吸收度的不同进行测量；（2）在PCR反应体系中添加荧光探针，用荧光信号来实时监控PCR反应过程，最后用标准曲线对未知模板处理[2]；（3）数字PCR将微量样品进行大量分级的稀释和分液处理，使待测分子数不超过1个，在进行PCR的扩增，使得含有1个目标分子的样品放大至几百万倍，产生强大的荧光信号，对发生了扩增反应的样品计数[3]。

1 数字PCR检测原理

数字PCR是一种基于单分子模板PCR扩增，进行核酸拷贝数精确定量的分析方法[4]。基础原理如图1所示：

图1 PCR检测的基础原理

首先把样品分散到独立的反应单元，然后在一个板上进行多个独立扩增反应，如荧光定量PCR一样采用引物和荧光探针，阳性反应单元记为1，阴性反应单元记为0[5]。接着用软件进行阳性及阴性反应单元数数，最后进行泊松分布的计算，得出最终扩增的拷贝数量。如图2所示：

黑色小点代表阳性反应单元，白的小点代表阴性反应单元。根据泊松概率分布公式进行计算：

p=e（1）

其中：λ表示单位反应单元中DNA分子的平均数量；

p表示在λ的条件下，单位单元中所含有的k个 DNA分子的浓度；

设稀释系数为m，则有λ=cm，c为样品的原始数量。当k=0时，p =eλ=e-cm，与此同时，p=，n-f为没有标记荧光时的分子反应数目，n为参与反应的分子总数目。所以：

=e-cm？陴cm=ln（1-）（2）

2 数字PCR荧光检测仪的软件模型设计

该软件模型总体分为三个大块：USB驱动和信号的检测分析和处理模块；包含特定算法的逻辑运算模块；可视化的面板设置模块。总体模块设计如图3所示。

其中USBManager主要功能：（1）USB数据的读取和保存操作；（2）对数据处理（调用算法），并把峰值数据等保存到wellCtrl中；（3）显示当前运行样本的信息；（4）USB读取异常处理；myMiniPlateCtrl（96孔板）主要功能：（1）选择样本；（2）更新画图和GridView显示（3）保存选取样本的设置。dataGridView主要功能：（1）把用户选中样本（孔）的每个通道的数据显示；（2）把GridView显示的样本信息导出，并保存为Excel或CSV格式的文件。fileManager主要功能：（1）读取和保存 Plate文件（2）读取和保存TemplatePlate文件（3）读取和保存 通道的.FCS文件（4）保存通道数据 至 wellCtrl类。

concentrationPage面板中的包含循环阈值（Cycle threshold）的设置，对于一个PCR反应，达到循环阈值时：

Nt=N0（1+E）（3）

其中，N0是初始模板的拷贝量，CT是循环阈值即扩增反应的循环次数，Nt是第CT个循环反应时产物的拷贝数。将上式两边分别取对数，得到：

计算出循环阈值

对于特定的PCR反应，理想情况下，扩增效率E和CT个循环反应的拷贝数Nt均为定值，因此CT值与初始模板拷贝数N0的对数成反比关系。

3 实验

在实验室的环境下，分别用两组曲线图来描述理想和非理想情况下PCR的反应曲线图。理想情况下的PCR反应曲线图：Nt=N0*2，其中横坐标CT表示反应次数，纵坐标Nt是第CT个循环反应时产物的拷贝数。

图4 理想情况下的PCR反应曲线图

非理想情况下的PCR反应曲线图：Nt=N0（1+E）CT。

4 结束语

数字PCR的市場前景大有可观。各国科学家们致力于数字PCR的研发，已诞生了多种dPCR（Digital PCR）装置，如液滴式、旋流片式、滑动芯片式、集成流路芯片式等。商业化的dPCR平台也在不断面世。国内一些科研单位和公司也进行了相关研发，致力于高端仪器国有化、低成本化[6]。通过把计算机技术运用在生命科学领域，能极大推动医学发展，该软件模型为用户提供了友好的人机交互，功能模块划分明确；但是系统中仍然存在一些不足之处有待改进：

（1）实时定量PCR（qPCR）无法分辨2倍以下的基因表达差异或拷贝数变异，难以鉴定频率低于1%的等位基因[7]。

（2）USB的串口通信不够灵敏，建议改进驱动程序的算法。

【参考文献】

[1]李春勇.数字PCR技术原理及应用[J].生物技术世界，2014（11）：10-13.

[2]何浩.基于DSP的实时PCR仪温度控制系统的研制[D].北京：北京工业大学，2014.

[3]牟颖，金钦汉.一种大有前途的分析和诊断新技术：大规模集成流路（IFC）芯片-数字PCR[J].现代科学仪器，2010（1）：21-23.

[4]Dingle TC， Sedlak RH， Cook L， et al. Tolerance of droplet-digi-tal PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances[J].Clinical Chemistry，2013， 59（11）：1670-1672.

[5]罗磊.实时荧光PCR芯片系统设计及其生物学应用[D].武汉：华中科技大学，2010.

[6]王惠，钱冲，郭峰，关超，苏长青，白洪志.实时定量PCR检测技术研究进展[J]. seed，2013（6）：43-47.

[7]金钦汉.一种将改变人类“命”运的新技术[J].科学前沿，2010（07）：32-33.

[责任编辑：朱丽娜]