李子英,丛日春,*,杨庆山,周 健

1 中国林业科学研究院荒漠化研究所, 北京 100091 2 山东省林业科学研究院, 济南 250014

柳树为杨柳科柳属(Salix)植物,其树干高大通直,生长快,寿命长,材质优,抗性强,既是重要的园林绿化植物,也是用材林和农田防护林的常用树种[17]。目前,关于柳树耐盐性的研究主要以中性盐NaCl胁迫[18]和碱性盐Na2CO3、NaHCO3胁迫[19-20]为主,而其对于混合盐碱胁迫的响应研究较少。“盐柳1号”(Salixpsammophila‘Yanliu NO. 1’)来源于内蒙古沙漠地带的灌木北沙柳,是山东省林业科学研究院经过十多年的研究和选育,从中选育出的一个乔木品种。本研究将NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3按不同比例混合,模拟出12种盐度和碱度各不相同的盐碱条件,对盐柳1号盆栽幼苗进行处理,研究混合盐碱胁迫对盐柳1号幼苗生长和渗透调节物质含量的影响,以探索盐柳1号的耐盐碱范围和耐盐碱生理特性。

1 材料与方法

1.1 材料培养

试验材料为柳树无性系“盐柳1号”(山东省林业科学研究院提供),取长15 cm、直径1 cm左右的柳树当年生插条,于2016年3月份定植于口径和高均为15 cm的塑料花盆内,栽培基质为洗净的河沙和适量珍珠岩,并用多菌灵进行消毒。每盆1株,每3盆一组作为3个重复。扦插定植后,用1/2Hogland营养液进行浇灌并在温室内培养,温室内的昼夜温度为25/18℃。培养45 d后,选取长势相对一致的柳树幼苗进行试验。

1.2 模拟盐碱设计

将2种中性盐NaCl、Na2SO4和2种碱性盐NaHCO3、Na2CO3按不同比例混合,按碱性盐比例逐渐增大的顺序分成3个处理组(分别用A、B、C表示)。每组内设4个浓度梯度(分别用1、2、3、4表示),其混合盐总浓度依次为50、100、150、200 mmol/L,其中A1表示A处理组浓度为50 mmol/L的处理,依此类推。共模拟出12个混合盐碱组合。从表1可以看出,组内pH值的变化明显小于组间,因此分析数据时以同组各浓度pH值的平均值作为该组的pH值,所以A、B、C处理组的pH值分别为8.04、8.66、9.47。

“A”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3= 1∶2∶1∶0比例配成混合盐溶液的处理组；“B”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=1∶9∶9∶1比例配成混合盐溶液的处理组；“C”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3= 1∶1∶1∶1比例配成混合盐溶液的处理组

1.3 盐碱胁迫

选13组长势相对一致的柳树幼苗,1组浇1/2Hogland营养液作为对照,其余12组进行A1—A4、B1—B4、C1—C4的编号,分别用含有相应浓度的混合盐溶液进行胁迫处理,处理间隔为3 d,每次浇100 mL/盆。为避免盐冲击现象,胁迫处理时盐浓度每次增加50 mmol/L,直至达到设定浓度。处理期间,定期定量补水。胁迫处理14 d后采集柳树幼苗相应部位的功能叶片进行指标测定。

1.4 指标测定

1.4.1 株高生长量的测定

测定胁迫前后各处理组柳树幼苗的株高H1和H2,株高生长量=胁迫后的株高H2-胁迫前的株高H1。

1.4.2丙二醛(MDA)含量的测定[21]

称取0.5 g植物样品,先加10%三氯乙酸(TCA)2 mL,研磨匀浆后再加入3 mL TCA进一步研磨,研磨后所得匀浆在3000 r/min下离心10 min,取所得上清液2 mL于带塞玻璃试管中,加入0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液2 mL,混合后于沸水浴上反应20 min,迅速冷却后离心,上清液分别于532、600、450 nm波长下测定吸光度值。对照管以2 mL蒸馏水代替提取液。

1.4.3脯氨酸含量的测定[22]

称取0.5 g植物样品置带塞玻璃试管中,加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液,在沸水浴中提取10 min(提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2 mL提取液于另一干净的带塞玻璃试管中,加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30 min,溶液即呈红色。冷却后加入4 mL甲苯,摇荡30 s,取上层液在3000 r/min下离心5 min。轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色皿中,以甲苯为对照,在520 nm波长处比色,求得吸光度值。

1.4.4可溶性糖含量的测定[22]

称取0.3 g植物样品,剪碎,放入带塞玻璃试管中,加入10 mL蒸馏水,于沸水中提取30 min(提取2次),提取液过滤入25 mL容量瓶中,反复漂洗试管及残渣,定容至刻度。吸取样品提取液0.5 mL于20 mL刻度试管中,加蒸馏水1.5 mL,然后向试管中加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5 mL浓硫酸,充分震荡,立即将试管放入沸水浴中,逐管均保温1 min,取出后自然冷却至室温,以空白作参比,在630 nm波长下测定吸光度值。

1.5 数据处理

运用Excel 2016、SPSS 19.0对试验数据进行处理和分析,采用单因素方差分析对不同盐浓度和不同pH值下各生理指标的差异性进行显著性分析,多重比较采用Duncan法。

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫对柳树幼苗株高生长量的影响

衡量植物耐盐性最直接的指标就是盐胁迫后植株的高度,它是体内各种代谢反应的综合表现[23]。在混合盐碱胁迫下,盐柳1号幼苗的生长受到了不同程度的抑制。如图1所示,随着盐浓度的增大,A、B、C处理组的株高生长量均呈降低趋势,且均显著低于CK(P<0.05),并在盐浓度200 mmol/L时均降至最小值。其中,A处理组的株高生长量相对CK依次降低了27.20%、45.48%、53.18%、61.32%；B处理组的株高生长量与CK相比依次降低了29.65%、46.82%、63.77%、68.67%；C处理组幼苗的株高生长量与CK相比依次降低了31.22%、55.96%、66.33%、73.02%,且在盐浓度高于150 mmol/L时叶片全部枯黄。在同等盐浓度条件下,随着碱性盐比例(pH值)的增高,盐柳1号幼苗的株高生长量均呈降低趋势。在盐浓度50、100和150 mmol/L时,A、B、C处理组的株高生长量差异均不显著(P>0.05)。

图1 混合盐碱胁迫对柳树幼苗株高生长量的影响Fig.1 Effect of complex saline-alkali stress on plant height increment of willow seedlings“A”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3 =1∶2∶1∶0比例配成混合盐溶液的处理组；“B”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3 =1∶9∶9∶1比例配成混合盐溶液的处理组；“C”表示按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3 =1∶1∶1∶1比例配成混合盐溶液的处理组;不同小写字母表示在0.05水平上差异显著

2.2 盐碱胁迫对柳树幼苗叶片丙二醛(MDA)含量的影响

盐碱胁迫下植物体内氧自由基代谢失衡,细胞膜受到活性氧攻击产生膜质过氧化,最终细胞膜的结构和功能遭到破坏。如图2所示,随着盐浓度的增大,A、B、C处理组的MDA含量均呈整体升高趋势,且均高于或显著高于CK。其中,A处理组的MDA含量增幅较小,与CK相比差异均不显著(P>0.05)；B处理组的MDA含量在盐浓度大于100 mmol/L时开始显著增加(P<0.05)；C处理组的MDA含量均显著高于CK(P<0.05)。A、B处理组的MDA含量在盐浓度200 mmol/L时均达到最大值,分别相对CK增加了23.82%、154.29%；C处理组的MDA含量在盐浓度100 mmol/L时达到最大值,与CK相比显著增加了41.83%(P<0.05)。在盐浓度50 mmol/L时,A、B、C处理组的MDA含量差异均不显著(P>0.05)。

图2 混合盐碱胁迫对柳树幼苗叶片丙二醛含量的影响Fig.2 Effect of complex saline-alkali stress on MDA content in leaves of willow seedlings

2.3 盐碱胁迫对柳树幼苗叶片脯氨酸含量的影响

游离脯氨酸是一种可溶性蛋白,与水具有极强的吸附性,是参与植物渗透调节的主要物质之一。如图3所示,随着盐浓度的增大,A、B、C处理组的游离脯氨酸有不同程度的积累。其中,A、C处理组的脯氨酸含量均呈先升高后降低趋势,且分别在盐浓度150、50 mmol/L时达到最大值,分别相对CK增加了72.58%、14.66%；B处理组的脯氮酸含量在盐浓度150 mmol/L时达到最大值,与CK相比显著增加了158.75%(P<0.05)。从整体来看,A、C处理组的脯氨酸含量增幅较小,与CK相比差异均不显著(P>0.05)；B处理组的脯氨酸含量在100 mmol/L以下盐浓度范围内增加缓慢,而在高盐胁迫下骤然增加。在同等盐浓度条件下,A、B、C处理组的脯氨酸含量差异均不显著(P>0.05)。

图3 混合盐碱胁迫对柳树幼苗叶片脯氨酸含量的影响Fig.3 Effect of complex saline-alkali stress on proline content in leaves of willow seedlings

2.4 盐碱胁迫对柳树幼苗叶片可溶性糖含量的影响

随着盐浓度的增大,A、B、C处理组的叶片可溶性糖含量呈间断性积累(图4)。其中,A处理组的叶片可溶性糖含量呈先升高后降低趋势,与CK相比差异均不显著(P>0.05),并在盐浓度100 mmol/L时达到最大值,相对CK增加了35.25%；B处理组的可溶性糖含量在盐浓度150 mmol/L时开始显著增加,在盐浓度200 mmol/L时达到最大值,与CK相比显著增加了313.99%(P<0.05)；C处理组的叶片可溶性糖含量均显著高于CK(P<0.05),且在盐浓度100 mmol/L时达到最大值,与CK相比显著增加了48.45%(P<0.05)。在盐浓度50 mmol/L时,A、B、C处理组的可溶性糖含量差异均不显著(P>0.05)。

图4 混合盐碱胁迫对柳树幼苗叶片可溶性糖含量的影响Fig.4 Effect of complex saline-alkali stress on soluble sugar content in leaves of willow seedlings

2.5 胁变指标与盐浓度和pH值的方差分析

方差分析表明(表2),不同盐浓度和盐组合(pH值)以及两者间的交互作用对盐柳1号幼苗的叶片MDA含量和可溶性糖含量的影响均达到极显著(P<0.01)；不同盐浓度对株高生长量和脯氨酸含量的影响均达极显著水平(P<0.01)；不同pH值对株高生长量的影响达到极显著(P<0.01),对脯氨酸含量的影响不显著(P>0.05)；交互作用对株高生长量和脯氨酸含量的影响均不显著(P>0.05)。盐浓度对各胁变指标的影响明显大于pH值的影响。

表2 盐浓度和pH值及其交互作用对柳树幼苗不同胁变指标的影响

“*”表示差异显著,P<0.05 (*: significant differenceP<0.05); “**”表示差异极显著,P<0.01 (**: significant differenceP<0.01);“NS”表示差异不显著,P>0.05 (NS: not significant)

3 讨论与结论

植物在环境胁迫下生长会受到抑制,混合盐碱胁迫对植物生长的影响尤为显著[24]。本研究中,在混合盐碱胁迫下,盐柳1号幼苗的生长受到了不同程度的抑制。A、B、C处理组的株高生长量随着盐浓度、pH值的递增均呈降低趋势,尤其是在碱性盐比例较高的C处理组(pH值为9.47),在高盐胁迫下盐柳1号幼苗的叶片全部枯黄(C3、C4)。这说明在混合盐碱胁迫下,盐柳1号幼苗不仅受到盐浓度的影响,而且还受到高pH的协同作用,这与李玉梅在牛叠肚幼苗上的研究结果类似[25]。

植物遭受逆境胁迫时细胞膜首先会受到伤害,丙二醛(MDA)是植物膜脂过氧化的产物,MDA含量越高,说明植物受伤害的程度越大[26]。闫永庆等[27]研究表明,随着盐、碱浓度的加大,白刺叶片质膜所受伤害逐渐增大,MDA含量增加。本研究中,在混合盐碱胁迫下,盐柳1号幼苗的叶片MDA含量随着盐浓度的增大有不同程度的增加,这表明氧自由基已诱发膜脂过氧化,细胞膜受到不同程度的伤害。其中,A处理组的MDA含量增加幅度不大,说明盐柳1号幼苗叶片质膜受伤害程度不大；B处理组的MDA含量在盐浓度高于100 mmol/L时骤然增加,说明盐柳1号幼苗叶片膜质过氧化程度加剧,植株受害加重；C处理组幼苗在盐浓度高于150 mmol/L时叶片全部枯黄,说明盐柳1号幼苗已失去对盐碱胁迫的应激能力。

盐胁迫会造成植物渗透胁迫、膨压丧失[28],植物体通过增加渗透调节物质来增大细胞质浓度,以平衡液泡和细胞质的水势,平衡渗透势,防止液泡从细胞质中吸水,避免细胞质这个代谢中心受到影响[29-31]。脯氨酸和可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质,郝凤等[32]研究发现,随着盐碱胁迫浓度的增大,植物体在积累脯氨酸的同时,糖的合成也增加。本研究中,随着盐浓度的增大,盐柳1号幼苗的叶片脯氨酸和可溶性糖含量均有所上升。在低盐胁迫下(100 mmol/L以下),A、B、C处理组的脯氨酸和可溶性糖含量变化均不明显；在高盐胁迫下(150 mmol/L以上),A处理组的脯氨酸和可溶性糖含量增加不显著,B处理组的脯氨酸和可溶性糖含量骤然增至最大值,C处理组幼苗的叶片全部枯黄。说明盐柳1号幼苗对混合盐碱胁迫具有一定的耐受性,当超过耐受范围时植株大量积累脯氨酸和可溶性糖,以此来缓解盐碱胁迫带来的伤害,直至承受不住高盐高碱的胁迫作用而死。

混合盐碱胁迫并不是盐、碱两种胁迫的简单叠加,而是有一定协同效应[33]。本研究中,在低盐度时(50 mmol/L),pH值虽然由7.91增至9.33,但叶片MDA含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量的变化均不明显,说明单纯碱胁迫作用较小；在低碱度时(A组),虽然盐浓度由50 mmol/L增至200 mmol/L,但叶片MDA含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量的增加幅度不大,说明单纯盐胁迫作用也较小。而当盐胁迫与碱胁迫共同作用时(C3、C4),盐柳1号幼苗的叶片全部枯黄,说明盐与碱的协同效应会对植物造成更大的伤害。

本研究结果表明,在高盐低碱或高碱低盐的条件下盐柳1号幼苗可以正常生长,盐浓度低于100 mmol/L的混合盐碱胁迫对盐柳1号的生理变化影响不大；盐浓度高于150 mmol/L,pH > 9.51时会对盐柳1号造成较大的伤害。

[1] 何磊, 陆兆华, 管博, 赵艳云, 王睿彤, 刘洋. 盐碱胁迫对甜高粱种子萌发及幼苗生长的影响. 东北林业大学学报, 2012, 40(3): 67- 71.

[2] Parida A K, Das A B. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2005, 60(3): 324- 349.

[3] 赵可夫. 植物抗盐生理. 北京: 中国科技出版社, 1993.

[4] 杨科, 张保军, 胡银岗, 王淑华, 薛晓峰. 混合盐碱胁迫对燕麦种子萌发及幼苗生理生化特性的影响. 干旱地区农业研究, 2009, 27(3): 188- 192.

[5] 殷丽华, 徐鹏, 柯希望, 王志辉, 张盼盼, 宋大巍, 刁静静, 郑殿峰, 左豫虎. 混合盐碱胁迫对绿豆种子萌发与幼苗生长发育的影响. 黑龙江八一农垦大学学报, 2015, 27(5): 40- 43.

[6] 陈金元, 陈学林, 满吉琳, 郭楠楠. 混合盐碱胁迫对红砂种子萌发的影响. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2016, 44(5): 113- 119.

[7] 丁俊男, 迟德富. 混合盐碱胁迫对桑树种子萌发和根系生长的影响. 中南林业科技大学学报, 2014, 34(12): 78- 82.

[8] 吴旭红, 陈晓娥. 盐碱胁迫对甜瓜种子萌发期氮代谢及渗透调节能力的影响. 种子, 2015, 34(12): 89- 93.

[9] 郭园, 张玉霞, 杜晓艳, 于华荣, 刘涛. 盐碱胁迫对油用向日葵幼苗生长及含水量的影响. 东北农业科学, 2016, 41(2): 20- 24.

[10] 石德成, 盛艳敏, 赵可夫. 不同盐浓度的混合盐对羊草苗的胁迫效应. 植物学报, 1998, 40(12): 1136- 1142.

[11] 石德成, 盛艳敏, 赵可夫. 复杂盐碱生态条件的人工模拟及其对羊草生长的影响. 草业学报, 1998, 7(1): 36- 41.

[12] 石德成, 李玉明, 杨国会, 李毅丹, 赵可夫. 盐碱混合生态条件的人工模拟及其对羊草胁迫作用因素分析. 生态学报, 2002, 22(8): 1323- 1332.

[13] 石德成, 盛艳敏, 赵可夫. 复杂盐碱条件对向日葵胁迫作用主导因素的实验确定. 作物学报, 2002, 28(4): 461- 467.

[14] 王晨, 陈吉宝, 庞振凌, 李南南, 董海鸿, 李丹丹. 甜高粱对混合盐碱胁迫的响应及耐盐碱种质鉴定. 作物杂志, 2016, (1): 56- 61.

[15] 刘晓静, 张晓磊, 齐敏兴, 刘艳楠. 混合盐碱对紫花苜蓿种子萌发及幼苗期叶绿素荧光特性的影响. 草地学报, 2013, 21(3): 501- 507.

[16] 闫艳华, 杜京旗, 高晓丽. 碱性复合盐胁迫对番茄幼苗生理的影响. 黑龙江农业科学, 2015, (12): 82- 83.

[17] 王宁, 周晓星, 刘俊祥, 巨关升, 韩蕾, 孙振元. 盐胁迫对柳树无性系SH31离子含量及光合作用的影响. 林业科学研究, 2015, 28(4): 565- 569.

[18] 隋德宗, 王保松, 王伟伟. 盐胁迫对灌木柳2个无性系渗透调节物质含量的影响. 江苏林业科技, 2014, 41(6): 1- 3, 20- 20.

[19] 刘铎, 丛日春, 党宏忠, 李庆梅, 刘德玺, 杨庆山. 柳树幼苗渗透调节物质对中、碱性钠盐响应的差异性. 生态环境学报, 2014, 23(9): 1531- 1535.

[20] 吴薇, 高捍东, 魏树强. 水培盐碱胁迫对杂交新美柳生根特性的影响. 林业科技开发, 2008, 22(3): 32- 34.

[21] 陈建勋, 王晓峰. 植物生理学实验指导. 2版. 广州: 华南理工大学出版社, 2006.

[22] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术. 北京: 高等教育出版社, 2001.

[23] 王保平, 董晓燕, 董宽虎. 盐碱胁迫对紫花苜蓿幼苗生理特性的影响. 草地学报, 2013, 21(6): 1124- 1129.

[24] 盛彦敏, 石德成, 肖洪兴, 许月. 不同程度中碱性复合盐对向日葵生长的影响. 东北师大学报: 自然科学版, 1999, (4): 65- 69.

[25] 李玉梅. 牛叠肚幼苗对盐碱胁迫的生理响应机制研究[D]. 沈阳: 沈阳农业大学, 2016.

[26] 张永平, 陈幼源, 陈绯翔. 盐碱胁迫对甜瓜种子萌发的影响. 上海农业学报, 2009, 25(4): 22- 25.

[27] 闫永庆, 刘兴亮, 王崑, 樊金萍, 石溪婵. 白刺对不同浓度混合盐碱胁迫的生理响应. 植物生态学报, 2010, 34(10): 1213- 1219.

[28] 刘斌, 张文辉, 马闯, 刘新成. 不同能源柳无性系对NaCl胁迫的生理响应. 生态学报, 2010, 30(4): 895- 904.

[29] 王秀娟, 杨会青. 盐碱胁迫下西伯利亚白刺的渗透调节物质的变化. 热带农业科学, 2010, 30(2): 34- 36.

[30] 闫永庆, 王文杰, 朱虹, 石溪婵, 刘兴亮, 祖元刚. 混合盐碱胁迫对青山杨渗透调节物质及活性氧代谢的影响. 应用生态学报, 2009, 20(9): 2085- 2091.

[31] 肖强, 郑海雷, 陈瑶, 黄伟滨, 朱珠. 盐度对互花米草生长及脯氨酸、可溶性糖和蛋白质含量的影响. 生态学杂志, 2005, 24(4): 373- 376.

[32] 郝凤, 刘晓静, 张晓磊, 齐敏兴. 混合盐碱胁迫对紫花苜蓿苗期氮磷吸收及生理特性的影响. 中国沙漠, 2015, 35(5): 1268- 1274.

[33] 吴薇, 高捍东, 蔡伟建. 盐碱胁迫和NO处理对杂交新美柳根系活力的影响. 南京林业大学学报: 自然科学版, 2008, 32(4): 59- 62.