赵 敏，唐诗邈，刘冬妍

·论著·

高氧环境下ROS对肠上皮细胞表达TNF-α和HIF-1-α的影响

赵 敏，唐诗邈，刘冬妍*

目的 探讨长时间高氧治疗对机体造成严重不良反应的原因。方法 用不同浓度的H2O2(100、200、400 μM)和85%的高氧对肠上皮细胞干预24 h后，采用免疫组织化学方法检测高氧对TNF-α和HIF-1-α的影响。结果 与对照组相比，高氧组和各H2O2组TNF-α和HIF-1-α表达水平显著增加(P<0.05)，并且高氧组明显高于H2O2组。结论 高氧环境中肠上皮细胞的损伤伴随着ROS的增加，因此认为在高氧环境中ROS对肠道损伤发挥着重要作用。

高氧；活性氧；过氧化氢；TNF-α；HIF-1-α

0 引言

高氧是治疗一些新生儿疾病必不可少的治疗措施，但是长时间的高氧治疗可能会对新生儿机体器官产生严重的毒性作用。在正常情况下，体内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的生成和清除维持着动态平衡，ROS过量对机体器官产生损伤。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是炎症反应的中心介质，作为一种促炎细胞因子，能够在高氧状态下介导炎症反应[1]。低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor-1-α，HIF-1-α)在修复缺氧诱导基因和细胞氧环境中起着关键作用，并反映一些关于缺氧诱导和氧化应激方面的信息[2]。本研究观察了高氧及H2O2处理后的Caco-2细胞表达TNF-α和HIF-1-α的变化，探讨ROS是否为高氧对肠道损伤的主要因素。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人类结肠癌细胞系Caco-2细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.1.2 主要试剂与仪器 SeriesⅡ 3110 CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)、超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、倒置显微镜(北京欣惠泽奥科技有限公司)、ST 16离心机(德国Thermo公司)。DMEM细胞培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、双抗(中国Genview公司)；青霉素-链霉素(美国Biological Industries公司)；过氧化氢(上海国药集团化学试剂有限公司)；鼠SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉生物科技有限公司)；抗TNF-α、HIF-1-α抗体(英国Abcam公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将Caco-2细胞置于含有10% 胎牛血清、1% 谷氨酰胺和1%双抗的DMEM培养液中，在37 ℃、5% 的CO2孵箱中培养，生长达80%融合时，消化传代。

1.2.2 实验分组 将细胞(1×106cells/mL)接种到六孔板中的盖玻片上培养，达到融合状态后，分别加入不同浓度的H2O2(100、200、400 μM)处理24 h，或85%高氧孵育24 h，对照组在正常孵箱中培养，不施加任何处理因素。

1.2.3 免疫组化检测ROS对Caco-2细胞的影响 细胞经4%的多聚甲醛、3% 的H2O2和山羊血清处理后，用鼠抗人TNF-α、HIF-1-α(1∶2 000)抗体4 ℃孵育过夜，然后用山羊抗小鼠抗体和辣根酶标记链霉卵白素37 ℃孵育，苏木素复染，阴性对照组使用PBS替代抗体。图像分析软件Image J扫描计算平均吸光度值。

2 结果

2.1 ROS对TNF-α表达的影响 阴性对照组中，没有阳性细胞染色。对照组细胞染色呈浅黄色，实验组细胞呈黄或棕褐色(图1A)，即被100 μM H2O2处理的细胞TNF-α染色呈黄色，被200 μM H2O2、400 μM H2O2和高氧处理的细胞，TNF-α染色呈棕色或棕褐色。被高氧处理的Caco-2 细胞TNF-α的表达明显高于对照组和H2O2组(P<0.001) (图1B)。

2.2 高氧环境下ROS对HIF-1-α蛋白表达的影响 高氧和H2O2处理后，HIF-1-α免疫组化染色结果如图2。对照组HIF-1-α蛋白有少量的表达，主要集中于细胞浆。而实验组中，HIF-1-α蛋白表达均有阳性结果，细胞浆呈黄或棕褐色，随着H2O2浓度的增加以及在高氧中HIF-1-α阳性细胞数越来越多，细胞浆染色越来越明显。高氧组的HIF-1-α表达明显高于其他组(P<0.001) (图2B)。

图1 H2O2及高氧对Caco-2细胞TNF-α表达的影响(n=6)

图2 H2O2及高氧对Caco-2细胞HIF-1-α表达的影响(n=6)

3 讨论

细胞内氧化还原状态是决定细胞生长状态的一个关键因素[3]。氧化应激是一种特殊的细胞应激状态，能够产生氧自由基等物质[4]。细胞内ROS的平衡在防止病理状态的改变和促进细胞内信号转导的过程中起着重要的作用[5-6]。一方面，ROS能够活化细胞信号分子[7]，调节不同的细胞功能，包括氧化还原反应中的能量代谢，应激反应和生长信号[8]。另一方面，ROS调控着细胞的生长和死亡[9]。过多生成的ROS以氧化应激的形式减弱细胞自身的抗氧化能力，进而导致严重的细胞损害[10]。

ROS在线粒体中产生，主要包括氧离子和H2O2[11]。H2O2是有氧代谢主要的副产品[12]，可以显著降低超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和脂肪酶的活性[13]。同时,H2O2影响许多细胞内信号通路，调节关键信号蛋白的活性，通过激活蛋白酪氨酸激酶促进酪氨酸磷酸化[14]。因此，我们研究了不同浓度的H2O2对肠上皮细胞的影响。有文献报道，高氧能够引起抗氧化反应，促进机体产生更多的ROS，增加ROS的抗氧化反应和抗氧化蛋白的表达[15-17]，同时，过多的ROS也能导致危重患者器官的损伤[18]。

炎症反应时,ROS能够诱导细胞因子的产生[19]。TNF-α主要是由单核巨噬细胞、淋巴细胞产生的细胞因子。当肠道黏膜屏障受损时,肠道黏膜Th1细胞因子如TNF-α和白介素-1可以刺激上皮细胞产生ROS。TNF-α通过诱导细胞内线粒体ROS的产生导致细胞损伤，进而增加肠道炎症和损伤[20-21]。TNF-α在肠上皮细胞的高表达暗示其可能是肠道损伤的指示因子[20]。本研究结果显示，100 μM H2O2处理后，Caco-2 细胞TNF-α表达明显高于对照组和各H2O2组，充分证明了H2O2和高氧能够诱导TNF-α的表达，进而导致肠上皮细胞的损伤。

在细胞质中，TNF-α能够激活NF-κB信号通路[22]。NF-κB也能调节炎症反应和上皮细胞损伤或死亡[23]。一个完整的NF-κB通路需要有适当的氧和配体介导的 HIF的激活[24]。HIF-1-α与炎症性肠病的发病机制高度相关，并且HIF-1-α在免疫细胞中的作用越来越重要[25]。本研究结果显示，随着H2O2浓度的增加，HIF-1-α阳性结果也越来越明显，高氧组HIF-1-α的表达明显高于其他组，充分证明了在高氧环境中ROS诱导TNF-α和HIF-1-α的表达显著增加。ROS在体外能明显抑制肠上皮细胞的生长，诱导细胞的凋亡和死亡，其对肠上皮细胞损伤的程度随着浓度的增加而升高，表明高氧环境中肠上皮细胞的损伤伴随着ROS的增加，ROS在高氧状态下对肠上皮细胞损伤发挥着重要作用。

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Influence of ROS on intestinal epithelium TNF-α and HIF-1-α during hyperoxia

ZHAO Min,TANG Shi-miao,LIU Dong-yan*

(Medical Research Center,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To explore the reason of severe adverse effects by prolonged hyperoxia treatment.Methods The intestinal epithelium cells were treated with different concentrations of H2O2(100,200,400 μM)and 85% oxygen for 24 h.The expression levels of TNF-α and HIF-1-α were detected by immunohistochemistry.Results Compared with control group,the expression levels of TNF-α and HIF-1-α were significantly increased in hyperoxia group and H2O2groups,and the expression levels of TNF-α and HIF-1-α were higher in hyperoxia group than those in H2O2groups (P<0.05).Conclusion The injury of intestinal epithelial cells in hyperoxia environment is accompanied by ROS increase.So we make a conclusion that ROS plays an important role in intestinal injury in hyperoxia environment.

Hyperoxia;ROS；H2O2；TNF-α；HIF-1-α

2016-10-27

中国医科大学附属盛京医院实验研究中心，沈阳110004

国家自然科学基金(30871158、81170604);辽宁省教育厅科学计划研究项目(LK201620)；盛京自由研究者基金

10.14053/j.cnki.ppcr.201702001

*通信作者