张晓俊　李承德　王煜　孙宏伟　毛淑梅

[摘要] 目的 探讨伴发抑郁行为后支气管哮喘大鼠体内P物质、皮質醇含量的变化。 方法 Wistar大鼠随机分为对照组（C组）、哮喘组（A组）、哮喘伴发抑郁组（A+D组），采用卵蛋白（ovalbumin，OVA）激发法建立哮喘模型，通过慢性轻度不可预见性应激（CUMS）诱发抑郁，评价动物哮喘及抑郁表现，检测大鼠血液及肺组织P物质、皮质醇的含量。 结果 ①伴发抑郁后，哮喘大鼠肺部病变进一步加重。②与C组比较，A组、A+D组大鼠血浆及肺组织P物质含量均显著升高（P < 0.05），且A+D组水平高于A组（P < 0.05）。③与C组比较，A组血液及肺组织皮质醇含量明显降低（P < 0.05）；而与A组比较，A+D组血液及肺组织皮质醇含量显著升高（P < 0.05）。 结论 OVA激发复合CUMS可制备支气管哮喘伴发抑郁大鼠模型，该模型P物质、皮质醇含量均较单纯哮喘发生明显变化。

[关键词] 支气管哮喘伴发抑郁；模型；P物质；皮质醇

[中图分类号] R562.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（c）-0021-05

Influence of bronchial asthma with coexisted depression on levels of cortisol and substance P in rats

ZHANG Xiaojun1 LI Chengde1 WANG Yu1 SUN Hongwei2 MAO Shumei1

1.Department of Pharmacology， Weifang Medical College The Key Laboratory of Applied Pharmacology in Shandong Province， Shandong Province， Weifang 261053， China； 2.Department of Applied Psychology， Weifang Medical College， Shandong Province， Weifang 261053， China

[Abstract] Objective To detect the changes in levels of cortisol and substance P in rats of asthma with coexisted depression. Methods Wistar rats were randomly divided into the control group （group C）， asthma group （group A） and asthma with coexisted depression group （group A+D）. The group A and group A+D were sensitized with ovalbumin for 4 weeks. Then the group A+D was exposed to a CUMS procedure for another 4 weeks. Asthmatic manifestations and depressive-like behaviors were investigated. Levels of substance P and cortisol were measured by radioimmunoassay. Results ①The asthmatic manifestations of group A+D were worse than the group A. ②Rats in group A and group A+D had much higher levels of substance P than the rats in group C （P < 0.05）； group A+D had even higher substance P levels than group A （P < 0.05）. ③Levels of cortisol in group A significantly decreased if compared to the group C （P < 0.05）； however， levels of cortisol in group A+D significantly increased if compared to the group A （P < 0.05）. Conclusion Ovalbumin excitation combined with CUMS can establish asthma with coexisted depression moldel in rats， which had higher levels of substance P and cortisol than the rats only with asthma.

[Key words] Bronchial asthma with coexisted depression； Rat model； Substance P； Cortisol

支气管哮喘是一种发病率很高的呼吸系统疾病[1-2]，众多支气管哮喘患者伴发抑郁情绪，而抑郁在哮喘的发生、发展和预后中发挥着重要的作用[3-5]。研究发现，单发哮喘或单发抑郁时体内P物质含量均升高，此外哮喘时皮质醇分泌减少，而抑郁时皮质醇分泌增加[5]。当患有哮喘伴发抑郁时P物质、皮质醇将如何变化未见报道。本研究拟建立支气管哮喘伴发抑郁的大鼠模型，观察其P物质、皮质醇含量的变化，探索其对哮喘的影响，为疾病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 實验动物 健康Wistar大鼠，雄性，24只，体重200～220 g，购自山东大学实验动物中心，合格证号：SCXK（鲁）2003-0004。大鼠适应环境7 d后，随机分为对照组（C组）、哮喘组（A组）、哮喘伴发抑郁组（A+D组），每组8只，每笼4只饲养。

1.1.2 药品试剂与仪器 卵蛋白（OVA，美国Sigma公司）；氢氧化铝（淄博化学试剂公司）；P物质、皮质醇放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；雾化泵（德国PARI公司）；BH6020型组合式γ计数器（北京核仪器厂）；大鼠敞箱、游泳箱、大鼠束缚盒、明暗颠倒装置均根据文献[6-7]自制。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 将24只Wistar大鼠随机分为对照组（C组）、哮喘组（A组）、哮喘伴发抑郁组（A+D组）。哮喘模型制备过程：分组后，大鼠腹腔注射致敏液（1 mL/只，含OVA 100 mg，氢氧化铝200 mg），2周后大鼠接受连续4周的雾化吸入1% OVA（每天20 min，流量40 mL/20 min），4周后改为每5天接受雾化吸入1次[7]。A组不予以慢性轻度不可预见性应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）。A+D组：以A组相同的方式诱发哮喘，完成4周雾化吸入OVA后，予以大鼠4周的CUMS，刺激包括夹尾180 s，束缚1 h，禁水48 h，禁食48 h，冷水游泳5 min（4 ℃），电击足底（电压30 V，电击15 s后间歇5 s）共进行120 s，热环境5 min（45 ℃），噪声干扰2 h，昼夜节律和光照性质改变，鼠笼倾斜，潮湿垫料等[7-8]。对照组致敏与激发均以生理盐水取代OVA，不予以CUMS。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fuid，BALF）分类细胞及计数 处死大鼠后，迅速分离一侧肺脏，以生理盐水进行充分灌洗，收集灌洗液，3000 r/min离心10 min，分类计数BALF中炎症细胞。

1.2.3 肺组织病理变化 取大鼠另一侧新鲜肺组织，常规HE染色，光镜下观察肺组织炎症细胞浸润等病理变化；1%锇酸固定小块肺组织，超薄切片并进行铀铅染色，电子透射显微镜下观察肺Ⅱ型细胞超微结构的变化。

1.2.4 糖水偏好度实验 正式测试前先训练大鼠饮用1%蔗糖水。禁食禁水24 h后，每只大鼠分别予以两瓶液体，分别为纯水与1%蔗糖水，大鼠自由摄取液体2 h，计算每瓶液体的消耗量。糖水偏好度=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）×100%。该实验在模型制备前后分别测试1次。

1.2.5 Open-field实验 将大鼠置于敞箱（100 cm×100 cm×80 cm，均分为25格）中心，大鼠在安静环境中自由探索3 min，对大鼠活动情况进行录像，然后由经过培训的专业人员计数大鼠水平活动及垂直活动得分[4]。测试每只后，用70%酒精对敞箱进行清洁处理。该实验在模型制备前后分别测试1次。

1.2.6 P物质、皮质醇含量测定 实验结束时，各组大鼠于8∶00～10∶00经颈总动脉取血2 mL置于防凝管，加入抑肽酶40 μL，3000 r/min离心10 min，血浆分装后置于-80℃保存。取肺组织进行匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清液分装置于-80℃保存。P物质、皮质醇含量测定严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 支气管肺泡灌洗液中炎症细胞计数

由表1可见，与C组比较，A组、A+D组大鼠BALF中巨噬细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞及中性粒细胞计数显著升高（P < 0.05）；与A组比较，A+D组大鼠上述炎症细胞数量进一步升高（P < 0.05）。

2.2 大鼠肺组织HE染色

C组大鼠肺泡轮廓清晰完整，间隔形态无异常，未见显著炎症细胞浸润；A组大鼠肺泡轮廓欠清晰，部分肺泡扩张，肺泡壁明显水肿、增厚，可见大量炎症细胞浸润；A+D组大鼠肺泡破坏较A组进一步加重，肺泡壁水肿增厚更加显著，炎症细胞浸润更加明显。见图1。

2.3 电镜观察大鼠肺Ⅱ型细胞超微结构情况

A组大鼠肺Ⅱ型细胞线粒体明显肿胀，线粒体嵴模糊，板层小体结构受损，染色质聚集深染；A+D组大鼠肺Ⅱ型细胞结构破坏较A组更加显著，线粒体肿胀明显，线粒体嵴断裂，板层小体结构受损，排空现象明显。见图2。

2.4 三组大鼠糖水偏好度比较

由表2可见，造模前C组、A组及A+D组大鼠糖水偏好度差异无统计学意义（P > 0.05）；造模后，与C组比较，A+D组大鼠糖水偏好度显著降低（P < 0.05），而A组无显著变化（P > 0.05）。

2.5 各组大鼠Open–field实验活动得分情况

由表3可见，造模前C组、A组及A+D组大鼠水平活动得分及垂直活动得分差异均无统计学意义（均P > 0.05）；造模后，与C组比较，A+D组大鼠水平活动得分及垂直活动得分均显著降低（P < 0.05），而A组无显著变化（P > 0.05）。

2.6 各组大鼠P物质含量变化

由表4可见，与C组比较，A组、A+D组大鼠血浆及肺组织P物质含量均显著升高（P < 0.05），且A+D组水平显著高于A组（P < 0.05）。

2.7 各组大鼠皮质醇含量变化

由表4可见，与C组比较，A组血液及肺组织皮质醇含量明显降低（P < 0.05）；而与A组比较，A+D组血液及肺组织皮质醇含量显著升高（P < 0.05）。

3 讨论

本实验参考了目前普遍采用的OVA致敏激发方法[7]略加改进制备哮喘模型，在此基础之上，采用文献中广泛应用的CUMS法[7-8]进一步使动物出现抑郁。实验结果显示，A组及A+D组大鼠具有哮喘病的一般表现及肺组织病理改变等特性，后者尚出现糖水摄取下降、Open–field实验中大鼠水平活动得分及垂直活动得分显著下降，表明兼备了抑郁的特征，提示哮喘伴发抑郁模型制备成功。

P物质是一种非肾上腺素能非胆碱能物质，报道显示哮喘时体内P物质含量升高[9]。研究表明，过高浓度的P物质可收缩气道平滑肌，增加微血管壁通透性，促进黏膜水肿的形成，激活嗜酸粒细胞等，促进了哮喘的病理过程。而NK1拮抗剂可以通过阻断P物质与NK1受体结合，而改善哮喘表现[10]。本实验结果显示，A组大鼠P物质显著升高，与上述观点一致。而本研究中尚发现A+D组大鼠体内P物质含量较A组进一步升高，与此一致的是A+D组大鼠哮喘表现进一步加重，说明P物质的变化可能是抑郁加重哮喘的一个重要因素。此外，有报道显示，P物质在中枢神经系统主要传递伤害性刺激，与应激密切相关[11-12]，它可通过与中枢NK1受体结合而发挥效应。NK1受体广泛分布于杏仁核、下丘脑、海马、纹状体及缰核等部位[13]，P物质与NK1受体的分布总体上相对应[14]。而这些部位均参与了应激反应及情感行为控制的调节，如抑郁和焦虑。据此推断，哮喘时体内过高的P物质与上述部位的NK1受体结合，引起患者的抑郁情绪，由此可见P物质是抑郁和哮喘病理过程的一个共同通路，这可以解释临床上哮喘患者为什么易伴发抑郁。据此，笔者建议采用P物质受体阻断剂来治疗哮喘伴发抑郁，可以同时起到阻止哮喘与抑郁发展的双重疗效。而P物质受体阻断剂在2004年国际神经精神药理学大会上被推荐为治疗抑郁症最有前途的一个新型药物。

HPA轴在哮喘的发生发展中起重要作用，研究显示，哮喘时该轴被抑制，皮质醇分泌减少[15]。此外文献报道，抑郁时因应激而损伤了海马，海马对HPA轴的抑制作用明显减弱，从而HPA轴亢进，皮质醇分泌增加[16]。本研究发现，A组大鼠血液皮质醇含量较C组显著降低，与文献报道相一致[17-18]；A+D组皮质醇较A组明显升高，说明此时体内HPA轴被激活，理论上这将有利于哮喘的恢复，但这与临床上哮喘伴发抑郁患者病情相对较重以及本研究中A+D组哮喘病变更重的现象相违背。有研究显示，心理应激可以改变哮喘动物糖皮质激素受体的数目以及受体对激素的敏感性[19-20]，这也可能也是本研究中虽然A+D组皮质醇含量较高，但哮喘仍重于A组的原因。

综上所述，哮喘伴发抑郁时P物质及皮质醇均发生了显著变化，P物质受体阻断剂可能是较理想的治疗哮喘伴发抑郁的药物之一。

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（收稿日期：2016-06-11 本文編辑：程 铭）