文德鉴 涂星 胡泽华 黄琼 朱敏英 刘芬 周国丽

摘要：目的 建立紫丁香苷、异嗪皮啶HPLC同步检测方法，考察接骨膏粉末用白醋、蜂蜜和凡士林为基质调敷时的体外透皮吸收特性，探讨土家族常用药膏基质的作用。方法 以离体大鼠腹部皮肤为透皮屏障，采用改良Franz扩散池模拟体外透皮吸收实验，用HPLC测定接收液中紫丁香苷、异嗪皮啶的含量，建立经皮吸收方程，计算累积渗透量、渗透速率等相关参数。结果 采用Syncronis C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.1%磷酸（20∶80），流速1.0 mL/min，检测波长265 nm，紫丁香苷回归方程A=10 686.454 6C+1565.778 8（r=1.000 0），异嗪皮啶回归方程A=12 297.305 4C-5913.729 9（r=0.999 9）。以白醋、蜂蜜和凡士林为基质调敷接骨膏粉末及不添加基质时，紫丁香苷的稳态透皮速率分别为7.549 2、4.580 3、3.890 8、5.378 4 ?g·cm-2·h-1，累积透过百分率分别为25.66%、16.11%、13.73%、18.78%；异嗪皮啶的稳态透皮速率分别为2.536 9、1.941 8、1.178 2、2.293 6 ?g·cm-2·h-1，累積透过百分率分别为47.04%、35.06%、22.11%、41.11%。结论 以白醋为基质，有利于促进接骨膏粉末中药效成分的经皮吸收；以蜂蜜和凡士林为基质，会阻滞接骨膏粉末中药效成分的经皮吸收，但可作为缓释基质使用。

关键词：蜂蜜；白醋；凡士林；接骨膏；紫丁香苷；异嗪皮啶；经皮吸收

接骨膏[1]（鄂药制字[2001]第MZ02-014号），为湖北民族学院附属民大医院于20世纪70年代初期开发的一种外用膏剂，处方来源于土家族民间流传甚广的“封刀接骨法”，原始方法是在四肢闭合性骨折手法复位后将活公鸡捣烂与土家族药物刺五加、刺老苞和独正杆配伍加工制成糊膏状，外敷跌打损伤的患处并固定。主治四肢骨折、跌打损伤（软组织损伤）、风湿疼痛等病症，有接筋续骨、疗伤止痛、活血化瘀等功效，研究表明该药对骨折的愈合、类风湿关节炎和膝骨关节炎骨髓水肿等均具有较好的治疗效果[2-7]。该制剂中刺五加为主药，其主要有效成分为紫丁香苷和异嗪皮啶等。本研究采用蜂蜜、凡士林、白醋作为基质调和接骨膏，以离体大鼠腹部皮肤为透皮屏障，采用改良Franz扩散池模拟体外透皮吸收实验，考察不同基质调敷接骨膏的经皮吸收药动学特征，为其制剂改良和临床运用提供参考。

1 仪器、试药与动物

Syncronis C18色谱柱（美国Thermo公司），V6A-02型Franz扩散池（接收池面积8 mL，通透面积1 cm2，美国Perme Gear公司），SC-15智能恒温槽（宁波新芝生物科技股份有限公司），HH-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），BAS224S电子分析天平（德国赛多利斯公司），Centrifuge 5810R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），KQ-600GVDV型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

刺五加、刺老苞、独正杆，自采，经湖北民族学院中医药学院朱敏英副教授鉴定，分别为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr. Et Maxim.）Harms的干燥根状茎、五加科植物黄毛楤木Aralia decaisneana Hance的根、葡萄科植物刺葡萄Vitis davidii Foex的根；凡士林（药用辅料），南昌白云药业有限公司；蜂蜜（药用辅料），江山市蜂农世家保健品有限公司；白醋，山西省太谷县双太酿造有限公司；紫丁香苷对照品（批号111574-201504）、异嗪皮啶（批号110837-201507），中国食品药品检定研究院；乙腈，美国默克公司；其他试剂均为分析纯。

SPF级SD大鼠，雌雄不限，5～6周龄，体质量（150±20）g，湖北省实验动物研究中心，动物许可证号SCXK（鄂）2015-0018。

2 方法与结果

2.1 紫丁香苷、异嗪皮啶含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件及系统适用性 色谱柱：Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（20∶80）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：265 nm；进样量：10 ?L。分别取200 ?g/mL紫丁香苷对照品溶液，100 ?g/mL异嗪皮啶对照品溶液，含紫丁香苷、异嗪皮啶分别为200、100 ?g/mL的混合对照品及阴性对照溶液（流动相）按上述色谱条件进样，结果见图1。由图可见，紫丁香苷的保留时间为10.02 min，异嗪皮啶的保留时间为25.38 min，分离度良好，流动相对样品无明显干扰，理论塔板数以异嗪皮啶计不少于3000。

2.1.2 标准曲线的制备 精密吸取50、100、250、500、5000 ?L混合对照品溶液，分别置5 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定紫丁香苷和异嗪皮啶的峰面积。以对照品溶液中待测成分浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，计算线性回归方程。结果紫丁香苷的回归方程为A=10 686.454 6C+1565.778 8，r=1.000 0；异嗪皮啶的回归方程为A=12 297.305 4C-5913.729 9，r=0.999 9。结果表明，紫丁香苷在2～200 ?g/mL、异嗪皮啶在1～100 ?g/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验 分别精密吸取混合对照品溶液50、250、5000 ?L，置5 mL容量瓶中，按“2.1.1”项下色谱条件，于1 d内重复进样5次，测定紫丁香苷和异嗪皮啶的峰面积，计算其日内精密度；于5 d内每日进样3次，测定紫丁香苷和异嗪皮啶的峰面积，计算其日间精密度。结果紫丁香苷、异嗪皮啶日内峰面积RSD分别为1.06%、0.98%，日间峰面积RSD分别为2.11%、1.76%，表明仪器的精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 分别精密吸取混合对照品溶液50、250、5000 ?L，置5 mL容量瓶中，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12 h进样3次，测定紫丁香苷和异嗪皮啶的平均峰面积，结果RSD分别为1.89%、1.25%，表明溶液稳定性良好。

2.1.5 加样回收率试验 精密吸取不同基质24 h的透皮样品溶液0.25 mL，分别精密加入0.25 mL混合对照品溶液，置5 mL容量瓶中，混合均匀后用0.22 ?m微孔滤膜过滤，取续滤液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定紫丁香苷和异嗪皮啶的含量，计算回收率。结果无基质和以蜂蜜、凡士林、白醋作为基质调敷的接骨膏中紫丁香苷的回收率RSD分别为2.47%、2.64%、4.65%、1.53%，异嗪皮啶的回收率RSD分别为3.40%、1.82%、4.65%、2.13%。各组RSD均低于5%，表明本方法的回收率符合生物样品的分析要求。

2.2 接骨膏经皮吸收药动学特性研究

2.2.1 样品的制备 分别取刺五加、刺老苞和独正杆粉碎过120目筛，按处方比例混合制成接骨膏粉末。取2 g置于具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量，超声提取40 min，用甲醇补足减失的质量，过滤，滤液过0.22 ?m微孔滤膜，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果其中含紫丁香苷685.640 4 ?g/g，异嗪皮啶125.951 5 ?g/g。精密称取3份接骨膏粉末1.00 g，置小烧杯中，分别精密加入蜂蜜、凡士林和白醋3.0 mL，搅拌均匀调成糊状，即得供试样品。

2.2.2 离体大鼠皮肤的制备 参照文献[8-9]，取SD大鼠，10%水合氯醛0.30 g/kg腹腔注射麻醉，用剃须刀剃去大鼠锁骨至腹部的毛，再用30 ℃的6%Na2S溶液轻轻擦拭，脱去短绒毛。放回鼠笼正常饲养3 d，脱颈椎处死，剪下腹部皮肤，用载玻片轻轻刮除皮下组织，用生理盐水漂洗干净，选择对光透视无穿孔和皮肤角质层完整的皮肤展开并润湿后置于玻璃板上，覆盖保鲜膜，置于-4 ℃冰箱保存备用。

2.2.3 体外透皮吸收试验 参照文献[8-9]，剪取合适大小（有效皮肤面积为1 cm2），固定于供体池和接收池之间，使角质层面向供体池，接收池中注入20%乙醇-生理盐水溶液，放入磁力搅拌转子，排尽接收池中的气泡，使接收液液面与皮肤层完全接触。设定磁力搅拌器转速为500 r/min，水浴温度（32±0.25）℃。启动水泵平衡0.5 h后，分别取以蜂蜜、白醋、凡士林调和的接骨膏粉末均匀敷于供体池皮肤表面，另取1份接骨膏粉末以1 mL水搅拌同法敷于供体池皮肤表面作为对照，于0.5、2、4、6、8、10、12、24 h分别取样1 mL，并补充32 ℃等量的新鲜接收液。所取样品液过0.22 ?m微孔滤膜，即得透皮吸收液样品。全部实验结束后，取下皮肤，用新鲜接收液清洗表面残留物，滤纸吸干水分，剪碎后加入甲醇5 mL超声提取2次，每次40 min，合并滤液，3000 r/min离心15 min，取上清液，用0.22 ?m微孔滤膜过滤，即得皮肤滞留样品。所有样品均按“2.1.1”项下色谱条件进样（色谱图见图2），每份重复5次，以紫丁香苷和异嗪皮啶的平均峰面积计算含量，并得出接骨膏经皮吸收药动学参数。

累积渗透量 Q_n=（VC_n+∑_（i=1）^（n-1）?C_i V_i）/A

稳态透皮速率 J=1/3600×dQ/dt

皮肤滞留量 Qs=VC/A

其中，A为有效扩散面积（1 cm2），V为接收液总体积（8 mL），Cn为第n次取样时接收液中药物质量浓度，Ci为第i次取样时接收液中药物质量浓度，Vi为取样量（1 mL）。以Qn对取样时间作曲线，进行线性拟合，计算回归方程，其直线斜率即为稳态透皮速率J，直线与横轴的交点为时滞tlag。结果见表1、图3、图4。

可见，不同基质调敷接骨膏粉末中紫丁香苷和异嗪皮啶经皮吸收过程的线性规律较明显，透皮速率恒定，符合零级模型；且不加基质的接骨膏粉末中紫丁香苷和异嗪皮啶的透皮速率和累积透过百分率均较高。无论是以紫丁香苷还是以异嗪皮啶为考察指标，其透皮速率和累积渗透百分率均为白醋>无基质>蜂蜜>凡士林，提示若以白醋为基质可促进接骨膏中主要药效成分紫丁香苷和异嗪皮啶的经皮吸收，以蜂蜜或凡士林为基质可达到缓释药效成分的目的。

3 讨论

3.1 紫丁香苷和异嗪皮啶含量测定方法的选择

《中华人民共和国药典》中刺五加的质量控制以异嗪皮啶为定性指标，以紫丁香苷为定量指标，相关文献也对这2个指标的检测进行了报道。隆颖等[10]以Diamomsil C18（200 mm×4.6 mm，5 ?m）为色谱柱，甲醇-水（20∶80）为流动相，流速1.0 mL/min，采用265、344 nm双波长可对紫丁香苷和异嗪皮啶进行检测。张崇禧等[11]采用ODS-C18色譜柱，乙腈-水（20∶80）流动相、流速1.0 mL/min、265 nm波长测定紫丁香苷，乙腈-甲醇-水-冰醋酸（17∶3∶80∶1）流动相、流速1.0 mL/min、344 nm波长测定异嗪皮啶。

本研究发现，紫丁香苷在220、265 nm波长处有最大吸收，异嗪皮啶在210、344 nm波长处有最大吸收，综合考虑最终采用Syncronis C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），乙腈-0.1%磷酸（20∶80）为流动相，1.0 mL/min流速，在265 nm波长处检测紫丁香苷和异嗪皮啶，线性关系、精密度、加样回收率等均较好，简化了紫丁香苷和异嗪皮啶的同步检测方法。

3.2 土家族常用药膏基质及其作用机制

土家族常用的药膏基质包括蜂蜜、白醋、蜂蜡、面糊、凡士林、松香、桐油等，由于皮肤刺激性和不利于保存等因素，目前最常用的主要是蜂蜜、白醋、凡士林和蜂蜡。

现代研究表明，凡士林流变学特性属于膨胀流动，具有一定的触变性，可起到缓释药物的作用[12]。本研究发现，以凡士林作为基质调敷接骨膏时其有效成分紫丁香苷和异嗪皮啶的透皮速率和累积渗透量均显著降低，与报道相符。

目前尚无研究表明白醋有促进药物经皮渗透的作用。本研究发现，以白醋作为基质调敷接骨膏粉末时可显著增加紫丁香苷和异嗪皮啶的透皮速率和累积渗透量，其原因可能是接骨膏粉末中紫丁香苷和异嗪皮啶与醋酸形成盐类，使药物易于透过皮肤[13]。

现代研究表明，蜂蜜作为一种高度复杂的糖类饱和溶液，还富含蛋白质、酸类化合物、酶类化合物、维生素和矿物质，具有保肝、缓泻、抗菌、加速创面修复、滋补强壮和促进组织再生的作用[14-15]。本研究发现，以蜂蜜作为基质调敷接骨膏时，其有效成分紫丁香苷和异嗪皮啶的经皮吸收速率和累积渗透量均显著降低，其原因可能与蜂蜜的黏性导致药物在皮肤的滞留时间延长有关。该结果与罗跃龙等[16]报道的蜂蜜可促进药物经角膜渗透不一致，可能与给药部位不一致及蜂蜜来源不同有关。

此外，刺五加具有益气健脾、补肾安神功效，用于脾肺气虚、体虚乏力、食欲不振、肺肾两虚、久咳虚喘，肾虚腰膝酸痛，心脾不足、失眠多梦等，通常内服使用。土家族医药中称刺五加为刺拐棒、坎拐棒子、一百针等，多外用治疗筋骨损伤。本研究发现，刺五加中主要药效成分紫丁香苷和异嗪皮啶可经过皮肤吸收，为其外用给药途经的合理性提供了参考。

土家常用药膏基质蜂蜜、白醋和凡士林如何影响接骨膏的经皮吸收，其作用机制与哪些因素有关，还有待进一步研究。

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（收稿日期：2016-03-16）

（修回日期：2016-04-20；编辑：陈静）