兰晓霞覃琨赵宏杨震高宏生赵化冰胡春秀

1武警后勤学院救援医学系（天津 300309）2天津出入境检验检疫局动植食检测中心3武警后勤学院科研部组织计划处4武警后勤学院附属医院妇产科

运动性骨疲劳大鼠血清代谢组学分析

兰晓霞1覃琨1赵宏2杨震3高宏生1赵化冰1胡春秀4

1武警后勤学院救援医学系（天津 300309）2天津出入境检验检疫局动植食检测中心3武警后勤学院科研部组织计划处4武警后勤学院附属医院妇产科

目的：用代谢组学方法筛选运动性骨疲劳的差异代谢产物，为运动性骨疲劳的早期筛查提供依据。方法：20只雌性SD大鼠，8周龄，体重210～250 g，适应性训练1周后随机分为对照组（C组，n=10）和模型组（T组，n=10）。对照组不训练，模型组进行递增负荷的跑台训练，6周训练结束后，用Instron 5800双立柱万能材料试验机测定大鼠胫骨骨刚度判定骨疲劳是否建模成功。血清样品经超高效液相色谱系统（UHPLC）分离后用Triple TOF 5600质谱仪（AB SCIEX）进行质谱分析，应用MetaboAnalysis软件进行多维统计分析和单维统计分析。结果：构建了正离子和负离子状态下偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型，其模型评价参数（R2，Q2）分别为（1.00，0.78）和（0.92，0.82）。共筛选出21个差异代谢产物，主要涉及色氨酸、酪氨酸，胆汁酸和磷脂代谢及丙氨酸-葡萄糖循环。具体来说，与对照组比较，模型组的L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、甘氨胆酸、牛黄胆酸和牛黄去氧胆酸上调，L-酪氨酸、L-犬尿氨酸、5-羟基多巴胺、5-羟色胺、吲哚乙酸、前列腺素、胆酸、石胆酸、脱氧鹅胆酸、卵磷脂、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂下调。结论：用代谢组学方法可初步筛选出运动性骨疲劳的差异代谢物，其早期诊断价值的评价有待进一步研究。

运动性骨疲劳；骨刚度；代谢组学；早期诊断

运动性骨疲劳[1]是指正常骨在反复负荷作用下的微损伤积累，主要表现为隐性疼痛，疼痛部位不具体，运动时症状加重，停止运动或运动负荷减轻时疼痛症状随之减轻。累积的疲劳微损伤和过多的骨重建可进一步演变成疲劳性骨折。因此，探索骨疲劳或疲劳性骨折早期诊断方法，就成为运动训练和军事训练中的一个非常有意义的研究课题。运动作为一种生理应激，在骨疲劳发生早期，机体能量代谢、脂代谢、蛋白质代谢和氨基酸代谢可能已经产生了明显的变化。目前，常规X线照射对于应力性骨折或骨疲劳的早期诊断灵敏性较低，而核磁、CT等检查手段又因价格昂贵而不易作为筛查的常规手段。代谢组学[2，3]能直接反映组织的生化状态，能够较灵敏地刻画生命体生理病理状态的变化，用代谢组学的方法来研究复杂疾病的早期诊断和预防颇具潜力。本研究通过建立大鼠骨疲劳模型，采用代谢组学方法筛选骨疲劳差异代谢标志物，旨在为建立一种相对无损、敏感、简单、费用低廉的运动性骨疲劳早筛技术提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 对象与分组

选用清洁级雌性8周龄SD大鼠20只，体重238.53±8.35 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供[许可证号：SCXK—（军）2012—0004]。所有大鼠经适应性训练1周后，采用随机数字表法将其分为对照组（C组，n=10）和模型组（T组，n= 10），对照组自由饮食，干笼饲养，不进行训练，动物室自然照明，实验组采用成都泰盟科技有限公司的FT-200三通道大鼠跑步机进行动物训练。

1.2 骨疲劳模型建立与判定

骨疲劳建模训练方案：1次/天，6天/周，第1周25 m/min，60 min/次，坡度0°，以后每周速度增加5 m/ min，至35 m/min不再增加；训练时间每周依次递增5、5、10、30、10 min/次，至120 min/次不再增加，坡度每周增加5°，至10°不再增加，共计训练6周。

模型判定：训练结束后用10%水合氯醛按0.3 ml/ kg剂量麻醉大鼠，处死后取下左右双侧胫骨，剔除肌肉组织，用浸满生理盐水的纱布包裹。用Instron 5800双立柱万能材料试验机进行三点弯曲实验，测定胫骨骨刚度，与对照组相比骨刚度下降20%作为骨疲劳判定标准[4]。设定载荷测量精度0.01 N，位移测量精度0.001 m，加载速度1.0 mm/min，跨距L=2 mm，预载3 N，匀速加载直至胫骨标本断裂。

1.3 检测方法

1.3.1 试剂与仪器

Triple TOF 5600+质谱仪（AB SCIEX）；Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪（Agilent）；低温高速离心机（Eppendorf5430R）；FA（Fluka，06450）；色谱柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×150 mm column；乙腈（Merck，1499230-935）；乙酸铵（Sigma，70221）。

1.3.2 血清取样及处理

血清采样及储存：实验结束后，用10%水合氯醛按0.3 ml/kg剂量麻醉大鼠后，行眶后静脉丛采血。每只大鼠采血1.5 ml放入5 ml EP管中，常温静置30 min，然后4℃静置1小时，离心15 min，转速为3500 rpm，取上清液分装于冻存管中密封，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，待测。

代谢组学的样品处理：代谢组学分析共采用2组大鼠血清样本，状态为液体，每组10份生物学重复样本。①样本预处理：取样品50 μL，加入200 μL预冷乙腈，涡旋混合30 s，13000 g 4℃离心15 min，取上清（分装为100 μL/管，共两管），真空干燥，冻干粉保存于-80℃待用；样本制备过程中，按照上述方法平行制备QC样本。质谱分析时加入40 μL乙腈水溶液（乙腈：水=8：2，v/v）复溶，涡旋，13000 g 4℃离心15 min，取上清液进样分析。②质控样本（QC）的制备：分别取每个样本10 μL混合为QC。QC样本用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性。

1.3.3 色谱--质谱分析

1.3.3.1 色谱分析

样品采用Agilent 1290 Infinity LC HILIC超高效液相色谱系统（UHPLC）进行分离。柱温25℃；流速300 μL/min；流动相组成A：水+25 mM乙酸铵+25 mM氨水，B：乙腈。梯度洗脱程序如下：0～1 min，为85% B；1～12 min，B从85%线性变化到65%；12～12.1分钟B从65%线性变化到40%，12.1～15 min，B维持在40%；15～15.1 min，B从40%线性变化到85%，15.1～20 min，B维持在85%。进样量4 μL；整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中每间隔10个实验样本设置1个QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。

1.3.3.2 QQ--TTOOFF质谱分析

分别采用电喷雾电离（ESI）正离子和负离子模式进行检测。样品经UHPLC分离后用Triple TOF 5600质谱仪（AB SCIEX）进行质谱分析。ESI源条件如下：Ion Source Gas1（Gas1）：60，Ion Source Gas2（Gas2）：60，Curtain gas（CUR）：20，source temperature：600℃，IonSapary Voltage Floating（ISVF）±5500 V（正负两种模式）；TOF MS scan m/z range：50-1000 Da，product ion scan m/z range：25-1000 Da，TOF MS scan accumulation time 0.20 s/spectra，product ion scan accumulation time 0.05 s/spectra；二级质谱采用information dependent acquisition（IDA）获得，并且采用high sensitivity模式，Declustering potential（DP）：±60 V（正负两种模式），Collision Energy：35±15 eV，IDA设置如下Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ions to monitor per cycle：10。

1.4 数据处理

原始数据经ProteoWizard转换成.mzML格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配（＜25 ppm）和二级谱图匹配的方式，检索实验室自建数据库和HMDB数据库。

对XCMS提取得到的数据，删除组内缺失值＞50%。采用autoscaling方法进行归一化，然后应用MetaboAnalysis软件进行多维统计分析和单维统计分析，包括无监督主成分分析（PCA）、有监督偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）、t检验和变异倍数分析。

2 结果

2.1 大鼠骨疲劳模型

6周训练结束后，采用Instron 5800进行胫骨的三点弯曲力学加载，表1显示对照组的骨刚度为255.721± 18.113 N/mm，模型组为185.558±15.860 N/mm，t= 5.339，P=0.001，模型组比对照组的骨刚度下降27.43%，达到了骨疲劳的诊断界值，提示大鼠骨疲劳建模成功。

表1 大鼠胫骨的骨刚度、弹性模量、最大载荷比较

2.2 血清样本的典型代谢谱图

对照和模型组样本经UHPLC-Q-TOF MS分析后得到的典型TIC图谱如图1和图2所示。

图1 对照组样品HILIC的典型TIC图谱

图2 模型组样品HILIC的典型TIC图谱

2.3 血清代谢组学数据的主成分分析（PPCCAA）

模型组（T）和对照组（C）组样本的PCA分析得分图见图3，由图3-A可见正离子模式数据在PC1和PC2维图上T、C组间没有明显的分离趋势；由图3-B可见负离子模式数据在PC1和PC2维图上T、C组间有一定的分离趋势。说明模型组大鼠血清在负离子模式下检测的代谢谱发生了一定改变，但正离子模式下检测的代谢谱改变较小。

图3 T-C组PCA得分图

2.4 血清代谢组学偏最小二乘判别分析（PLLSS--DDAA）

用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型，来实现对样品类别的预测。同时通过计算变量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力。所有PLS-DA模型经10次循环交互验证得到的模型评价参数（R2，Q2）列于表2，R2和Q2越接近1表明模型越稳定可靠。表2结果显示本实验正离子和负离子模式数据建立的PLS-DA模型模型解释和预测能力较强，模型可靠。

表2 PLS-DA模型的评价参数

2.5 血清代谢组学单变量统计分析

采用变异倍数分析（fold change analysis，FC Analysis）和t检验单变量分析方法，图4显示了以FC＞2.0且P＜0.05作为标准，筛选出的差异代谢物的火山图。

2.6 差异标志代谢物与KKGGEEEE注释

将同时具有多维统计分析筛选标准（VIP＞1）和单变量统计分析筛选标准（FC＞2.0且P＜0.05）的代谢物作为具有显著性差异的标志代谢物，并将得到的差异代谢物提交到KEGG网站，进行相关通路分析，详见表3。这21个差异代谢产物涉及到了氨基酸代谢，胆汁酸代谢，磷脂代谢、丙氨酸-葡萄糖循环及肠道菌群代谢的改变。其中，氨基酸代谢的差异代谢产物表现为L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸上调，L-酪氨酸，L-犬尿氨酸，5-羟基多巴胺、5-羟色胺吲哚乙酸下调；胆汁酸代谢的差异代谢产物表现为甘氨胆酸、牛黄胆酸、牛黄去氧胆酸上调，胆酸、石胆酸和脱氧鹅胆酸下调；磷脂代谢产物表现为卵磷脂、溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂下调。另外还有血清氨基葡萄糖、生物素和三氯葡萄糖醛酸下调。

图4 T-C组差异代谢物的火山图

表3 血清显著差异代谢物及KGEE通路注释

（续表3）

3 分析讨论

3.1 代谢产物与运动性骨疲劳

3.1.1 血清 55--HHTT、LL--犬尿氨酸、吲哚乙酸和LL--亮氨酸、LL--异亮氨酸

5-羟色胺是一种抑制性神经递质，研究发现[3]长时间或力竭运动均可以使大鼠中脑、纹状体、下丘脑和海马的5-HT浓度显著升高。色氨酸是5-羟色胺、犬尿氨酸、5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）等的重要前体物质，犬尿氨酸途径是色氨酸的主要代谢途径。本次实验未发现模型组大鼠血清f-TRP的表达与对照组出现有统计学意义的差别，但实验数据显示，模型组大鼠L-犬尿氨酸和吲哚乙酸这两种色氨酸的代谢产物表达量分别是对照组的0.40和0.29倍，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这可能与血清f-TRP通过血-脑屏障进入脑内的量增多，造成其在血液中分解代谢物浓度降低有关，也可能与大鼠慢性过度疲劳后机体自身调控有关。模型组大鼠血清犬尿氨酸水平降低，可能还与大部分犬尿氨酸能够通过血脑屏障，由血液进入脑部，诱发抑郁症状有关，我们发现模型组大鼠在骨疲劳发生时，出现明显的一系列中枢性运动疲劳的神经症状，如对光、声、电的刺激不敏感，逃避反应能力下降等。

中枢系统中5-HT合成量的多少主要取决于血浆中游离色氨酸（free tryptophan，f-TRP）入脑的含量，而脑内f-TRP浓度的高低取决于血浆中f-TRP浓度和异亮氨酸、亮氨酸等支链氨基酸（branchedchain amino acids，BCAA）浓度及其比值的高低。就支链氨基酸（BACC）而言，本实验数据显示模型组大鼠L-亮氨酸、L-异亮氨酸表达量升高，是对照组的1.68倍，差异有统计学意义（P＜0.05），说明骨疲劳时，体内脂肪大量动员。血浆游离脂肪酸浓度升高后，虽然为工作肌和其他器官提供了氧化代谢的底物，也节省了糖贮备的消耗，但血浆不饱和脂肪酸浓度过高时，可以对肌细胞膜的钠泵（钠离子三磷酸腺苷酶）及肌质网的钙泵（钙离子三磷酸腺苷酶）的功能产生抑制，两种酶水解三磷酸腺苷酶的能力减弱，影响肌质网对钙离子的摄取及肌细胞膜动作电位形成，使肌肉收缩过程和放松过程都受到影响[5]，这也是形成运动性疲劳的重要原因。

在人体实验中，尤其是训练监测或骨疲劳早期诊断时，直接进行中枢系统的5-HT含量测定并不可行，体内中枢神经系统与外周的5-HT分属两个独立的系统，但血液等外周组织5-HT的变化也可间接反映脑5-HT的变化，但二者之间到底是什么关系，相关文献报道非常少。本实验结果显示模型组大鼠血清中5-HT表达量是对照组的0.32倍，出现明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），推测与进入脑内的f-TRP增多有关，但由于实验中没有同时检测脑组织中5-HT的浓度，也不能提供二者关系的直接证据。

3.1.2 血清 55--羟基多巴胺、酪氨酸

多巴胺是中枢神经系统中重要的儿茶酚胺类神经递质，酪氨酸（tyrosine）是一种芳香族氨基酸，是合成儿茶酚胺类神经递质[6，7]。白宝丰等发现长期耐力训练可以提高大鼠中脑酪氨酸羟化酶（TH）含量，增加DA的合成量，从而增强了中枢的兴奋性，脑内多巴胺（DA）与激发促动肌肉协调能力及耐力运动的成绩密切相关，但随着运动疲劳的发生，脑内多巴胺浓度下降，降低了肌肉活动的协调性，导致疲劳发生。但血清中多巴胺浓度与运动能力关系的研究罕见报道。本实验发现骨疲劳时血清5-羟基多巴胺表达量均较对照组下降，是对照组的0.5倍，差异有统计学意义（P＜0.05），是否血清和脑内多巴胺水平存在同步变化的关系，有待实验证实。本实验发现大鼠骨疲劳时血清L-酪氨酸是对照组的0.46倍，差异有统计学意义（P＜0.05），这与以往补充酪氨酸可减轻自由基及过氧化对机体的损伤，提高运动能力，减缓体力疲劳的结果一致。

3.1.3 血清前列腺素

前列腺素（prostaglandin，PG）是存在于动物和人体中的一类不饱和脂肪酸组成的，按其结构的不同可分为A、B、C、D、E、F、G、H、I等类型。本次实验发现，模型组大鼠PGF1和PGF2的表达量为对照组的0.28～0.29倍，差异具有统计学意义（P＜0.05）。PGF是前列环素PGI2的无活性形式，而PGI2是花生四烯酸的代谢产物，一方面抑制前列腺素代谢，另一方面阻滞血小板的聚集释放，具有抑制血小板聚集、扩张血管的作用。而以花生四烯酸为前体的另一代谢产物血栓素A2（TXA2），其作用恰好相反，可以促进血小板聚集，与PGI2一样，TXA2生物半衰期仅约3 min，迅速代谢生成无活性的TXB2。因此，可通过测定TXB2和PGF的量间接地反映TXA2和PGI2的变化。有研究证实[8]，给狗添加前列腺素30天，可导致矿物沉积速率的增加，促进小梁骨和皮质骨的形成，并能增加血清Gla蛋白和碱性磷酸酶的水平；中等强度或有氧运动，可以使血液中的PGF浓度和PGF/TXB2比值增高，对于预防血栓形成所造成的心、脑血管疾病有益[9]，但过度训练或力竭运动中，大鼠血浆PGF浓度明显降低，TXB2浓度明显增高，TXB2/PGF显著升高。综上，本实验结果显示大鼠骨疲劳时，血小板聚集功能增强，造成组织的缺血缺氧，进而导致机体运动能力和抗疲劳能力下降；另一方面，过度运动所致的疲劳感增强，可使机体停止或减少运动，这可能是一种机体的自我保护机制。

3.1.4 其他代谢产物

本实验发现骨疲劳组大鼠胆酸、鹅脱氧胆酸和石胆酸明显降低，分别是对照组表达量的0.34～0.39倍，而血清甘氨胆酸、牛黄胆酸和牛黄去氧胆酸的表达量分别是对照组的3.47、3.18和3.07倍，提示骨疲劳发生时，肝细胞发生了损伤，同时，胆固醇降解作用加强，印证了运动的降脂作用[10，11]。模型组大鼠血清的卵磷脂、鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱的表达量显著下降，可能与骨疲劳时引发自由基产生和脂质过氧化程度增加，进而对红细胞膜结构产生了损害有关[12]。血清中葡萄糖和生物素表达降低可能与机体三大物质代谢增加消耗了生物素和糖元有关。而血清L-赖氨酸表达增加可能是机体拮抗中枢性疲劳和机体自由基氧化损伤的反馈性调节。我们还发现模型组大鼠血清三氯葡萄糖醛酸浓度与对照组比较显著下调（P＜0.05），80%的实验组大鼠（8/10）出现严重肠胀气和肠梗阻现象，说明大鼠骨疲劳发生时，发生了肠道菌群代谢紊乱。

3.2 代谢产物对于运动性骨疲劳的早期诊断价值

本次骨疲劳建模时间共计6周，在建模第3周时，模型组有2只大鼠就出现运动能力下降的外周运动疲劳症状，到训练第5周全部大鼠都出现了运动性外周疲劳症状，同时有3只大鼠出现中枢性运动疲劳症状，到训练第6周所有实验组大鼠都出现了中枢性运动疲劳的症状，提示外周性和中枢性运动疲劳可能早于骨疲劳出现。当出现外周性和中枢性运动疲劳后，运动负荷继续加载并反复作用于骨骼，骨骼出现微损伤，当这些损伤不断积累，超过机体的修复能力时就会出现骨疲劳，甚至导致骨折[13，14]。

4 总结

本研究发现骨疲劳大鼠血清中与色氨酸代谢、酪氨酸代谢、磷脂代谢、胆汁酸代谢、磷脂代谢等相关的21种代谢产物发生了有统计学意义的变化，提示这些代谢产物可作为运动性骨疲劳的早期筛查的潜在生物标志物。

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2016.1.21

院级重大项目（wjz2007-4）；武警医学院博士启动基金（WBS 200805）

赵化冰，Email：13820664530@163.com；胡春秀，Email：1183345173@qq.com