杨子博，顾正中，周羊梅，王安邦，高平中，熊正海，刘 畅，蒋学祥，沈业松

(江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所/淮安市农业生物技术重点实验室，江苏淮安 223001)

江苏淮北地区小麦品种资源籽粒硬度基因等位变异的KASP检测

杨子博，顾正中，周羊梅，王安邦，高平中，熊正海，刘 畅，蒋学祥，沈业松

(江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所/淮安市农业生物技术重点实验室，江苏淮安 223001)

为了解江苏淮北地区小麦品种资源的籽粒硬度概况及硬度基因型分布规律，以74份近年来江苏淮北地区所育品种(系)和38份来自黄淮其他麦区的常用亲本为材料，采用单籽粒谷物硬度测试仪、KASP标记检测技术和基因扩增及测序技术对其SKCS硬度值及硬度基因型进行鉴定。硬度检测结果表明，供试小麦品种(系)硬度变化范围较大，但硬质麦的比例最大，为70.5%。与常用亲本相比，江苏淮北地区育成品种中软质麦比例较高，为34.3%，但在高代品系中软质麦比例下降到20.5%。基因型检测结果表明，在 Puroindoline-D1位点，供试品种(系)中共检测到4种基因型，即野生型( Pina-D1a/Pinb-D1a)、 Pina-D1b、 Pinb-D1b和 Pinb-D1p，其频率依次为25.0%、2.7%、67.9%和4.5%。其中，野生型和Pinb-D1p主要分布在江苏淮北地区。不同硬度基因型的硬度值也存在差异，其中以 Pina-D1b基因型的硬度值最高，野生型( Pina-D1a/Pinb-D1a)硬度值最低， Pinb-D1b和 Pinb-D1p两硬质类型的籽粒硬度没有显著性差异。在 Pinb-2位点，供试品种(系)中共检测到25份材料为 Pinb-B2b基因型，包含21份硬质麦、2份混合麦和2份软质麦，其平均硬度值为63.8。

小麦；籽粒硬度；Puroindoline基因；KASP

小麦的籽粒硬度是重要的品质性状之一，其决定着小麦的出粉率、润麦加水量、面粉颗粒大小和最终的食品加工品质，是国际商品麦等级划分与定价的重要依据[1]。根据胚乳质地差异可将普通小麦分为硬质麦、软质麦和混合麦三大类。硬质、强筋小麦适合制作面包和优质面条，而软质、弱筋小麦则更适于制作饼干和糕点。先前研究表明，籽粒硬度主要由位于5D染色体短臂Ha(Hardness)位点的主效基因Pina和Pinb所控制[2-4]。小麦籽粒硬度的差异主要由Pina和Pinb基因的不同变异类型造成的，野生型的 Pina-D1a和 Pinb-D1a形成软质胚乳，Pina或Pinb基因的突变均会导致小麦胚乳变硬[2,5]。目前，已在普通小麦中发现11种Pina基因等位变异类型及20种Pinb基因等位变异类型[6-9]，其中 Pinb-D1b基因型在大多数国家或地区的硬质麦中出现的频率较高[10-11]。后来，Wilkinson等[12]和Chen等[13]又在普通小麦中发现了Pinb的同源基因 Pinb-2，其位于小麦第7同源染色体组上，两者同源性高达72%。截至目前，已发现了多种 Pinb-2变异类型( Pinb-2v1、 Pinb-2v2、 Pinb-2v3、 Pinb-2v4、 Pinb-2v5和 Pinb-2v6)，其中 Pinb-2v2和 Pinb-2v3互为一对等位基因，它们对籽粒硬度有一定的影响，但效应较Pinb小[14]。研究者利用STS标记、CAPS标记以及SDS-PAGE电泳等方法对中国陕西[15]、新疆[16]、山东[17]等多个省份小麦品种籽粒硬度的基因型进行了检测，以指导当地小麦品种的品质改良。近年来，KASP(kompetitive allele specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR技术，以其高度稳定性、准确性和低成本的特点，已经被广泛应用于高通量SNP分型以及InDels检测。最近，Rasheed等[18]开发了部分籽粒硬度基因的KASP标记，可以检测 Pina-D1b、 Pinb-D1b和 Pinb-B2b( Pinb-2v2的等位变异)等变异类型，并利用300份中国小麦材料进行了验证。江苏淮北地区常年小麦种植面积达130万hm2以上，约占全省粮食种植面积的40%[19]。研究江苏淮北地区小麦籽粒硬度分布及其基因组成，对该地区小麦品种的品质改良具有重要意义。而目前，关于该地区小麦品种资源籽粒硬度的研究却鲜有报道。鉴于此，本研究采用单籽粒谷物硬度测试仪、KASP标记检测技术和基因扩增及测序技术对江苏淮北地区近年来所育成小麦品种(系)的SKCS硬度值及硬度基因型进行鉴定，以期为该地区小麦品种的品质改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料共计112份，包括江苏淮北地区近年来所育成小麦品种35份、高代品系39份以及来自黄淮其他地区的常用亲本资源38份。于2014-2015年度种植于淮安市农科院试验田，每份材料种植2行，行长1.5 m，行距25 cm。田间管理按当地常规方法进行。经收获、晾干和整理后，用于籽粒硬度测定。

1.2 方 法

1.2.1 籽粒硬度的测定

籽粒硬度测定在中国农业科学院作物科学研究所品质育种实验室进行。利用单籽粒谷物硬度仪(SKCS 4100)测定300粒小麦样品的硬度值，一般测定值小于40多为软质麦，大于60多为硬质麦，介于二者之间多为混合麦(根据该样品的硬度分布比例而定)。

1.2.2 基因组DNA的提取

每份供试材料取30粒种子，室温下发芽，采用CTAB法[20]提取幼嫩叶片的基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，-20 ℃下保存备用。

1.2.3 KASP引物及KASP反应

用来鉴定 Pina-D1b、 Pinb-D1b和 Pinb-B2b变异类型的KASP引物由Rasheed等[18]设计并合成，引物序列见表1。共有三组混合引物，每一组混合引物都由两条末端碱基不同的等位基因正向引物(100 μmol·L-1)各12 μL、一条共同的反向引物(100 μmol·L-1)30 μL和46 μL ddH2O组成。PCR体系为5 μL,包括2.0 μL DNA (10 ng·μL-1)、2.5 μL KASP Master Mix (LGC Genomics,Hoddeston,UK)、0.07 μL 混合引物和0.43 μL ddH2O。为避免对试验结果的误判，设置空白对照，其DNA模板用ddH2O代替。PCR反应在S1000TMThermal Cycler PCR仪上进行，PCR程序为95 ℃热激活15 min；95℃变性20 s，65 ℃退火和延伸25 s，10个循环，每循环降低1.0 ℃)；95 ℃变性10 s，57 ℃退火和延伸60 s，30个循环。反应结束后利用Synergy H1全功能酶标仪读取荧光数据，通过SNPViwer2软件(LGC Genomics,Hoddeston,UK)生成基因分型图。

表1 籽粒硬度的KASP标记引物Table 1 KASP primers used in this study for kernel hardness

下划线部分为FAM标签序列；波浪线部分为HEX标签序列；除Pina-D1C、Pinb-D1C和Pinb-B2C为反向引物外，其他均为正向引物。

The underlined parts are FAM labeled sequences;The wave line parts are HEX labeled sequences；Pina-D1C,Pinb-D1C and Pinb-B2C are reverse primers,the other sequences are forward primers.

对于不属于 Pina-D1b和 Pinb-D1b基因型的硬质小麦，利用引物Pinb-D[10]扩增Pinb基因全长序列，其上游序列为5′-GAGCCTCAACC CATCTATTCAT-3′，下游序列为5′-CAAGG GTGATTTTATTCATAG-3′。PCR反应采用25 μL体系：10 × PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol·L-1)2.0 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.125 μL，其余用ddH2O补足。PCR反应在德国eppendorf系列PCR仪上进行，扩增程序如下：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性45 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸50 s，33个循环；72 ℃延伸5 min。将PCR产物送生工生物工程上海(股份)有限公司进行测序。通过Vector NTI 软件 (Invitrogen,Carlsbad,CA) 进行序列比对和分析，以确定其基因型。

2 结果与分析

2.1 供试小麦品种(系)的籽粒硬度及其分布频率

单籽粒谷物硬度仪的测定结果(表2)表明，供试的112份小麦品种(系)中，硬质麦有79份，占70.5%；混合麦有5份，占4.5%；软质麦有28份，占25.0%。籽粒硬度值变化范围较大，为7～85，其中，以郑麦379硬度值最大，豫教6号硬度值最小。在35份江苏淮北地区育成品种中，硬质麦和软质麦的比例分别为60.0%和34.3%；在黄淮其他地区的38份常用亲本中，两者的比例分别为74.0%和21.0%；在39份江苏淮北地区高代品系中，两者的比例分别为76.9%和20.5%。

单籽粒硬度频率分布可以反映某品种的均匀度，其数值的前四位分别代表硬度值≤33、34～46、47～59和≥60籽粒所占的比例，最后一位代表硬度等级。本研究中供试小麦品种籽粒的均匀度差别较大(表2)，如郑麦379的单籽粒硬度频率分布为00-01-02-97-01，其硬度等级为1级，有97%的籽粒硬度值≥60，表明其籽粒均匀度较高；鲁原502的籽粒硬度频率分布为03-11-22-64-01，虽然硬度等级同为1级，但仅有64%的籽粒硬度值≥60，表明该品种籽粒均匀度较低。

表2 供试小麦品种(系)的籽粒硬度值、硬度分布和基因型Table 2 SKCS hardness distribution and puroindoline genotypes of the tested wheat cultivars

(续表2 Continued table 2)

材料类型Materialtype品种(系)Cultivar(line)表现型Phenotype硬度值Hardness频率分布Frequencydistribution基因型Genotype洛麦29Luomai29软质Soft2868-15-09-08-04Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a漯麦4号Luomai4软质Soft2179-15-06-00-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a豫教6号Yujiao6软质Soft797-02-00-01-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a偃展4110Yanzhan4110软质Soft2580-11-05-04-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a轮选989Lunxuan989软质Soft3156-24-10-10-04Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a育成品种淮麦33Huaimai33硬质Hard7301-04-08-87-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2bBredvariety淮麦20Huaimai20硬质Hard7300-00-11-89-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b瑞华520Ruihua520硬质Hard6800-03-22-75-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b徐麦9158Xumai9158硬质Hard5707-16-30-47-02Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a连麦7号Lianmai7硬质Hard7202-02-10-86-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a泗阳1108Siyang1108硬质Hard6801-07-13-79-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦21Huaimai21硬质Hard7400-00-13-87-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦16Huaimai16硬质Hard7300-02-10-88-01Pina-D1a/Pinb-D1p/Pinb-B2a保丰10-82Baofeng10-82硬质Hard5706-13-32-49-02Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b连麦6号Lianmai6硬质Hard6905-03-15-77-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a连麦2号Lianmai2硬质Hard6901-03-19-77-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦17Huaimai17硬质Hard6405-07-20-68-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦30Huaimai30硬质Hard5901-12-38-49-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦39Huaimai39硬质Hard6103-13-27-57-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a徐麦32Xumai32硬质Hard7100-05-13-82-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦29Huaimai29硬质Hard6401-08-28-63-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b苏北麦1号Subeimai1硬质Hard6800-03-21-76-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b连麦8号Lianmai8硬质Hard6800-06-22-72-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b江麦919Jiangmai919硬质Hard5705-20-25-50-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b明麦16Mingmai16硬质Hard6402-10-27-61-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a连麦5号Lianmai5混合Mixed5516-12-22-50-03Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a徐麦33Xumai33混合Mixed5112-22-38-28-03Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a保麦218Baomai218硬质Hard6102-09-30-59-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a保麦2号Baomai2软质Soft8100-00-00-00-0Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2b淮麦22Huaimai22软质Soft2777-15-03-05-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦23Huaimai23软质Soft3162-28-05-05-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦11Huaimai11软质Soft2961-25-12-02-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦24Huaimai24软质Soft3055-34-06-05-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦27Huaimai27软质Soft3259-25-12-04-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦25Huaimai25软质Soft3546-36-15-03-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦31Huaimai31软质Soft3550-24-16-10-04Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦32Huaimai32软质Soft3642-42-12-04-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a明麦1号Mingmai1软质Soft2770-24-05-01-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦28Huaimai28软质Soft3159-29-07-05-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦35Huaimai35软质Soft2655-34-06-05-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a

(续表2 Continued table 2)

材料类型Materialtype品种(系)Cultivar(line)表现型Phenotype硬度值Hardness频率分布Frequencydistribution基因型Genotype高代品系淮核0779Huaihe0779硬质Hard8400-01-03-96-01Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-B2aAdvancedline淮核0838Huaihe0838硬质Hard6901-01-14-84-01Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦302Huaimai302硬质Hard6204-05-32-59-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a徐农0189Xunong0189硬质Hard7202-03-12-83-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a徐麦0054Xumai0054硬质Hard6602-04-19-75-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦4046Huaimai4046混合Mixed5211-20-32-37-03Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b连麦1219Lianmai1219硬质Hard8200-01-05-94-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b淮核00130Huaihe00130硬质Hard7200-02-18-80-01Pina-D1a/Pinb-D1p/Pinb-B2a淮核00134Huaihe00134硬质Hard7600-00-07-93-01Pina-D1a/Pinb-D1p/Pinb-B2a淮核12013Huaihe12013硬质Hard7600-00-12-88-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦04538Huaimai04538硬质Hard5803-16-38-43-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦04346Huaimai04346硬质Hard6701-04-22-73-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a连麦9825Lianmai9825硬质Hard7203-02-07-88-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a连麦0118Lianmai0118硬质Hard6901-03-19-77-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a连麦1203Lianmai1203硬质Hard7703-00-06-91-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a华瑞0712Huarui0712硬质Hard6803-02-22-73-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a瑞华1101Ruihua1101硬质Hard7501-02-05-92-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦304Huaimai304硬质Hard5110-29-27-34-02Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦04376Huaimai04376硬质Hard7200-02-16-82-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦04531Huaimai04531硬质Hard6900-07-09-84-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦02223Huaimai02223硬质Hard6105-14-21-60-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦07636Huaimai07636硬质Hard6701-06-18-75-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2a淮麦0218Huaimai0218硬质Hard6701-08-16-75-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b连麦1008Lianmai1008硬质Hard7206-07-06-81-02Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b连麦0366Lianmai0366硬质Hard6601-08-16-75-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b苏北麦619Subeimai619硬质Hard7600-00-07-93-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b连麦1213Lianmai1213硬质Hard6906-04-06-84-02Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b苏北麦0707Subeimai0707硬质Hard7600-00-07-93-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b徐农0029Xunong0029硬质Hard6201-12-26-61-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b淮麦04008Huaimai04008硬质Hard7001-02-12-85-01Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-B2b淮核12248Huaihe12248硬质Hard7100-00-17-83-01Pina-D1a/Pinb-D1p/Pinb-B2a淮麦07154Huaimai07154软质Soft3261-27-10-02-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2b淮核0516Huaihe0516软质Soft3154-37-05-04-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a徐麦1108Xumai1108软质Soft2769-22-05-04-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a连麦0608Lianmai0608软质Soft3162-28-05-05-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a瑞华055Ruihua055软质Soft3650-33-11-06-04Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦06124Huaimai06124软质Soft2479-12-05-04-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦02201Huaimai02201软质Soft1786-06-05-03-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a淮麦08026Huaimai08026软质Soft2965-20-13-02-05Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-B2a

2.2 供试小麦品种(系)硬度基因型的KASP检测

KASP检测结果如图1所示，图中每个圆点都对应着一个供试品种(系)，每组混合引物均会将112份供试品种(系)被分成两组，每组带有不同的颜色，蓝色代表该基因具有FAM标签序列，红色代表该基因具有HEX标签序列。图1A所示为利用引物组合Pina-D1_INS对供试材料进行KASP反应来鉴定 Pina-D1b基因型的结果，由该图可知，112份供试材料中，109份属于 Pina-D1a基因型，3份属于 Pina-D1b基因型，其中3份 Pina-D1b基因型材料均为硬质麦类型。图1B所示为利用引物组合Pinb-D1_INS对供试材料进行KASP反应来鉴定 Pinb-D1b基因型的结果，由该图可知，112份供试材料中，36份属于 Pinb-D1a基因型，76份属于 Pinb-D1b基因型，其中，76份 Pinb-D1b基因型材料包含71份硬质麦和5份混合麦。图1C所示为利用引物组合pinb2_IND对供试材料进行KASP反应来鉴定 Pinb-B2b基因型的结果，由该图可知，112份供试材料中，25份属于 Pinb-B2b基因型，87份属于 Pinb-B2a基因型，其中，25份属于 Pinb-B2b基因型的材料包含21份硬质麦、2份软质麦和2份混合麦。另外有5份硬质麦品种(系)不属于 Pina-D1b和 Pinb-D1b基因型中的任何一种，利用引物对Pinb-D扩增其Pinb基因全长序列，并对扩增产物进行测序，序列比对结果表明5份品种(系)均属于 Pinb-D1p基因型。

供试品种(系)被分成两组，分别位于X轴和Y轴，标为红色的品种(系)带有HEX型等位基因，标为蓝色的品种带有FAM型等位基因，黑色圆点为空白对照。

Scatter plots showing clustering of varieties(lines)on the X-axe and Y-axe; Varieties(lines)colored red have the HEX-type allele; Varieties colored blue have the FAM-type allele; Black dots represent the NTC (non-template control).

图1 供试小麦品种(系)硬度基因的KASP标记检测结果(硬度基因型散点图)

Fig.1 Detection for hardness genes of the tested wheat cultivars by KASP markers (scatter plots for hardness genotype)

2.3 不同硬度基因型品种(系)的硬度值及其分布

所调查的112份小麦品种(系)中，在 Puroindoline-D1位点存在四种基因型，在江苏淮北地区和黄淮其他麦区均有分布，其中 Pinb-D1b基因型占据主要地位，为67.9%；野生基因型( Pina-D1a/Pinb-D1a)主要分布在江苏淮北地区，占25.0%；有5份材料为 Pinb-D1p基因型，其中4份分布在江苏淮北地区；有3份材料为 Pina-D1b基因型，其中2份分布在江苏淮北地区。

对不同硬质类型的小麦品种(系)的硬度值进行分析，结果(表3)表明， Pina-D1b类型的硬度值为78.0，显著高于 Pinb-D1b(65.9)和 Pinb-D1p(71.7)类型， Pinb-D1b和 Pinb-D1p类型之间硬度值差异不显著，而上述三种硬质类型硬度值均显著高于野生型 Pina-D1a/Pinb-D1a(27.4)。对 Pinb-D1b类型中的不同 Pinb-2基因型品种(系)也进行了分析，其中22份同时含有 Pinb-D1b和 Pinb-B2b基因型品种(系)的平均硬度值为67.5，高于另外54份同时含有 Pinb-D1b和 Pinb-B2a基因型品种(系)的硬度平均值(65.2)，但两者差异尚未达到显著水平。同样，野生型中不同 Pinb-2基因型品种(系)硬度平均值间差异也不显著。可见， Pinb-2位点对籽粒硬度的效应较小。

3 讨 论

自籽粒硬度的特异性标记开发以来，分子标记和序列测定是检测小麦籽粒硬度基因型的常用方法。Semagn等[21]研究认为，与传统SNP检测平台GoldenGate相比，KASP检测方法更精确、费用更低且效率更高。Rasheed等[18]所开发的籽粒硬度基因相关的KASP标记，在一定程度上丰富了小麦籽粒硬度基因的检测手段，可大大加快较大样本的检测速度。本研究利用KASP标记结合序列测定准确、快速地鉴定出江苏淮北地区小麦品种(系)及常用亲本的籽粒硬度基因型，为该地区小麦品质育种过程中的亲本选配及高代品系改良提供了参考。

表3 Puroindoline-D1位点4 种基因型的表现型和 SKCS 硬度值Table 3 Comparison of phenotype and SKCS hardness index among four differentpuroindoline alleles at Puroindoline-D1 locus

同列数字后不同字母表示差异在5%水平上显著。

Different letters following the data within the same column indicate significant difference at 5% probability level.

张福彦等[22]对145份河南小麦新品种(系)的硬度值进行了检测，其中硬质麦、混合麦和软质麦比例分别为64.1%、18.9%和20.0%；张 晶等[15]测定了169份陕西小麦品种(系)的籽粒硬度，硬质麦、混合麦和软质麦分别占71.6%、6.5%和21.9%；王 亮等[16]对121份新疆小麦品种的硬度检测结果表明，三种硬度类型的分布比例分别为61.2%、14.0%和24.8%。同上述地区相比，江苏淮北地区近年来所育品种中硬质麦和混合麦的比例偏低，分别为60.0%和5.7%，而软质麦的比例明显偏高，为34.3%。这种情况可能是由长期以来该地区降雨偏多，空气湿度较大以及对小麦面粉加工品质要求不高等原因造成的。进一步分析江苏淮北地区所育的小麦高代品系，硬质麦的比例有了较大提高，为76.9%，而软质麦的比例降到了20.5%。这可能与该地区近年来小麦育种过程中注重了对小麦品质的改良，较多地选配硬质麦为亲本以及加强了对后代品系籽粒硬度的选择等原因有关。

本研究对来自黄淮麦区常用亲本硬度基因的检测结果表明， Pinb-D1b类型是黄淮麦区硬质麦的主要基因型，这与Xia等[6]和Chen等[9]的研究结果一致。对江苏淮北地区小麦品种资源硬度基因的检测结果表明， Pinb-D1b基因型占硬质麦的90.7%，稍高于陕西品种(80.2%)[15]和河南品种(87.1%)[22]。究其原因，江苏淮北地区硬质麦的遗传多样性较低，硬质麦基因类型不够丰富是导致 Pinb-D1b基因型比例较高的主要因素。该地区硬质麦中除 Pinb-D1b基因型外，另外有4份品种(系)为 Pinb-D1p基因型，有1份品种(系)为 Pina-D1b基因型，尚未发现 Pinb-D1d和 Pinb-D1e等其他硬度类型的品种(系)，而有研究发现[23]，拥有 Pinb-D1b、 Pinb-D1d和 Pinb-D1e类型的小麦在磨粉、馒头、面条和面包加工品质中一项或多项略优于其他类型，因此，在以后的小麦品质育种过程中，江苏淮北地区除需进一步利用 Pinb-D1b类型外，还应适当引进并利用 Pinb-D1d和 Pinb-D1e等相对优异基因类型的小麦资源。

对不同基因型的硬度值的方差分析表明， Pina-D1b基因型的硬度值最高，其与 Pinb-D1b和 Pinb-D1p两类型的硬度值均达到显著差异，而 Pinb-D1b和 Pinb-D1p两类型硬度值之间差异不显著。这与陈 锋等[24]和张福彦等[22]的研究结果一致。另外，本研究还对 Pinb-2位点的 Pinb-B2b基因型进行了初步分析，共检测到25份品种(系)带有 Pinb-B2b基因型，其中包括2份软质麦，平均硬度值为63.8，其显著低于 Pina-D1b、 Pinb-D1b和 Pinb-D1p基因型的硬度值。可见 Pinb-2位点对小麦籽粒的硬度效应较小，这与Chen等[14]的研究结果相一致。本研究对 Pinb-2位点的其他基因型尚未做检测，因此，该位点基因型在江苏淮北地区小麦品种资源中的分布还需进一步研究。

致 谢：中国农业科学院作物科学研究所何中虎研究员和夏先春研究员为本试验提供了检测平台，Awais Rasheed博士和徐开杰博士为本试验提供了技术指导和KASP引物，在此一并表示感谢！

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Detection of Allelic Variation for Grain Hardness in Huaibei Region of Jiangsu Province by KASP Markers

YANG Zibo,GU Zhengzhong,ZHOU Yangmei,WANG Anbang,GAO Pingzhong,XIONG Zhenghai,LIU Chang,JIANG Xuexiang,SHEN Yesong

(Huaiyin Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Region of Jiangsu Province/Huai'an Key Laboratory for Agricultural Biotechnology,Huai'an,Jiangsu 223001,China)

To clarify the situation of wheat kernel hardness and the distribution of puroindoline genes in wheat cultivars from Huaibei region of Jiangsu province,a total of 112 wheat cultivars (74 wheat cultivars from Huaibei region of Jiangsu province and 38 breeding parents from Yellow-Huai valley wheat region) were used to test the kernel hardness by a Single Kernel Characterization System (SKCS). The puroindoline genotype detection was performed in tested cultivars with KASP (Kompetitive Allele Specific PCR) markers and gene sequencing. The results indicated that the range of kernel hardness was much wider in tested cultivars,and hard wheat was a dominate type with the frequency of 70.5%. Compared with breeding parental cultivars,the percentage of soft wheat in bred cultivars from Huaibei region of Jiangsu province was higher (34.3%),which was decreased to 20.5% in advanced lines. Four puroindoline genotypes were detected in tested cultivars,including Pina-D1a/Pinb-D1a,Pina-D1b,Pinb-D1b and Pinb-D1p with the frequency of 25.0%,2.7%,67.9% and 4.5%,respectively.Among them,Pina-D1a/Pinb-D1a and Pinb-D1p mainly distributed in Huaibei region of Jiangsu province.The kernel hardness showed difference among different puroindoline genotypes,among which,the kernel hardness index of Pina-D1b was significantly higher than that of other genotypes. Varieties with Pina-D1a/Pinb-D1a showed the lowest kernel hardness index,but there were not significant difference between Pinb-D1b and Pinb-D1p. In addition,at the Pinb-2 locus,25 cultivars including 21 hard wheats,two soft wheats and two mixed wheats with Pinb-B2b allele were detected,with the average hardness index of 63.8.

TriticumaestivumL.; Kernel hardness; Puroindoline gene; KASP

时间：2017-01-16

2016-10-06

2016-11-22

江苏省科技支撑项目(BE2015352-6，BE2013439)；淮安市应用研究与科技攻关(农业)计划项目(HAN2014001)

E-mail：yangzibo1986@126.com

顾正中(E-mail:hynksgzz@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)02-0153-09

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