兰贤斌，彭韶平

(1.赣南医学院2014级研究生，江西 赣州 341000；2.赣南医学院第一附属医院耳鼻咽喉-头颈外科，江西 赣州 341000)

慢性化脓性中耳炎微生物学相关研究

兰贤斌1，彭韶平2

(1.赣南医学院2014级研究生，江西 赣州 341000；2.赣南医学院第一附属医院耳鼻咽喉-头颈外科，江西 赣州 341000)

慢性化脓性中耳炎(CSOM)是耳鼻咽喉头颈外科常见疾病之一，是中耳及乳突内不可逆慢性炎症改变。截至目前本病的发病原因和机制尚不完全明确，其病因复杂，发病与多种因素有关，主要包括感染、咽鼓管功能障碍及免疫功能不健全等。其中病原菌感染是引起CSOM最重要、最直接的外源性致病因素。目前，随着抗生素的广泛应用，CSOM病原菌对抗生素的敏感性逐渐降低，其病原菌组成也发生着变化。因此，尽早检测CSOM中病原菌及明确其药物敏感性，对临床治疗CSOM具有重要的指导意义。本文通过查阅近年国内外相关文献，就CSOM病原菌分布及其耐药性研究、病原菌检测和抗菌药物合理应用的部分相关问题作一介绍。

慢性化脓性中耳炎；微生物学；聚合酶链式反应

慢性化脓性中耳炎是指中耳骨膜、黏膜或深达骨质的慢性化脓性炎症，其病理学特征是中耳及乳突内出现的不可逆炎症改变[1]。CSOM是耳科常见病之一，在世界范围内发病率较高，但不同地区、不同民族发病率不一。阿拉斯加Inuits族的儿童、美国土著人和澳大利亚土著人发病率高达7%～46%；在非洲地区、印度、中国等发展中国家CSOM发病率在1%～7%；而发达的工业化国家美国、英国等CSOM发病率不足1%[2-3]。该病可发生于任何年龄段，临床症状主要表现为反复耳流脓、鼓膜穿孔、耳聋及耳鸣等。听力下降以中耳传音结构破坏所致的传导性聋为主，也可以表现为由病原菌破坏耳蜗所致的感音性聋。严重者或治疗不当者病灶侵及中耳周围骨质，可导致颅内、外并发症，引起严重后果；其反复感染及久治不愈，一直以来是临床医师感到棘手的问题[4]。

目前国内外学者一致认为感染、咽鼓管功能障碍和免疫功能不健全是CSOM的三大主要致病因素[5]。其次，近期的研究还强调了遗传、环境和社会地位等其他因素的作用，但CSOM与变态反应、上呼吸道感染、性别以及被动吸烟的关系尚未明确[6]。在这些致病因素中病原菌感染是引起CSOM最直接、最重要的外源性致病因素，没有病原菌的感染，很少单独引起CSOM[4]。细菌是引起CSOM的最主要病原菌，但近期研究认为在CSOM的微生物学研究中不能忽视了混合菌、真菌、厌氧菌及L型菌等感染。在临床上，CSOM患者抗菌治疗多以经验用药为主，这种缺乏针对性的抗菌治疗增加了CSOM病原菌耐药现象的产生，同时长期使用抗生素滴耳液造成耳部潮湿的环境可能是滋生真菌的重要诱因。因此，在CSOM患者使用抗菌药物之前，确定病原菌及明确其药物敏感性显得尤为重要。目前，传统病原菌培养为检测CSOM中病原菌最常用的方法。近年来随着分子诊断技术的飞速发展，以PCR技术为代表的新型病原菌检测方法也越来越被重视。

1 CSOM常见病原菌与地区差异

在CSOM中，病原菌可从鼻咽部通过咽鼓管到达中耳，也可以从外耳道通过穿孔的鼓膜到达中耳引起中耳炎症[7]。CSOM中分离出的需氧菌以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、变形杆菌(Proteusbacillus vulgaris)及肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)为主，其中以前两者最为常见[8-13]；最常见的厌氧菌为拟杆菌属、消化链球菌及梭形杆菌属；最常见的真菌为曲霉菌及念珠菌[2]。近年来，国内外大量文献报道CSOM分泌物病原菌检测出的主要病原菌种类相似，但是不同地区菌种分布不一。这可能与调查地区的环境、时期、采集的标本及培养方法、应用抗生素情况及病例选择等方面的差异有关。

1.1 需氧菌感染 国内外对CSOM病原菌中需氧菌分布的研究较为多见，虽然各地区检测出常见需氧菌种类差异不大，但是各菌种分布不一。在印度，Rajat等[14]对204例CSOM患者鼓膜穿孔处或鼓室内脓液分泌物进行培养，需氧菌阳性率为91.18%(186/ 204)，其中以金黄色葡萄球菌最多见(48.69%)，其次为铜绿假单胞菌(19.89%)、肺炎克雷伯菌(9.42%)、大肠杆菌(7.33%)及表皮葡萄球菌和变形杆菌(2.10%)。在非洲马拉维，Chirwa等[15]发现当地CSOM患者最常见的需氧菌以G-性菌多见(72.7%)，其中变形杆菌占28.6%、铜绿假单胞菌占20.8%及肺炎克雷伯菌占4.0%；G+菌以金黄色葡萄球菌最多见(20.1%)，其次为凝固酶阴性的葡萄球菌(4.0%)。Yeo等[16]统计2001-2005年间韩国1 102例CSOM患者细菌培养结果显示，胆脂瘤型与非胆脂瘤型中耳炎中病原菌谱类似，无明显差异。病原菌总检出率为84.3%，其中需氧菌的顺序为铜绿假单胞菌(31.8%)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(24.2%)、金黄色葡萄球菌(16.4%)、凝固酶阴性葡萄球菌(11.8%)及变形杆菌(1.4%)。该研究还发现每年8月份CSOM患者病原菌培养阳性率最高，具体原因还有待进一步研究。

1.2 厌氧菌感染 厌氧菌(naerobic bacteri)是一类在无氧条件下才能生长的细菌，这类细菌无完整的代谢酶体系，无氧发酵为其营养代谢方式[17]。由于厌氧菌的培养条件较高，在CSOM微生物学研究中对厌氧菌的研究报道较为少见。临床上，厌氧菌感染最典型的临床特征为耳部分泌恶臭脓液，且厌氧菌感染在胆脂瘤型中耳炎(67%～91%)中较非胆脂瘤型中耳炎(33%～51%)常见[18]。在世界范围内，Itzhak[19]结合不同国家及地区的20份(2 254例)关于CSOM厌氧菌研究报告发现，厌氧菌检出率为29%～71%，平均35%；主要为消化链球菌、梭形杆菌及拟杆菌等。其检出率不同可能是由于地域差异及实验技术差异所致。其致病机制可能为：一是由于各种原因导致的咽鼓管功能障碍，阻碍了中耳结构的通风引流，使鼻咽部厌氧菌移植增多；二是在CSOM发展过程中需氧菌与厌氧菌存在协同作用，需氧菌消耗组织中的氧，造成良好的缺氧环境，有利于厌氧菌的生长。因此，在CSOM微生物学研究中必须清楚地认识厌氧菌的作用，对于久治不愈且需氧菌培养阴性的CSOM需考虑厌氧菌感染可能，及时对其标本进行厌氧菌培养分析，指导临床治疗。

1.3 真菌感染 近年CSOM标本中真菌检出率有较大增长，其原因可能与长期使用局部广谱抗生素密切相关，加之鼓室、鼓窦及乳突气房炎症时黏膜水肿，引流不畅，局部环境潮湿及pH下降利于真菌生长。Schrader等[20]认为，CSOM患者在长期局部应用广谱抗生素治疗后，其真菌感染率明显增加，并将二重真菌感染视为局部广谱抗生素治疗CSOM的不良反应。Stern等[21]发现，CSOM患者在5～9月份真菌检出率较高，这可能与环境温度和湿度增高有关；其中青少年、合并糖尿病者及免疫缺陷者发病较多见。熊观燕等[9]报道，369例CSOM患者鼓室内脓液培养出真菌23株(6.23%)，其检出真菌主要为近平滑假丝酵母菌8株，黑曲霉、黄曲霉及西弗假丝酵母菌各3株，烟曲霉2株。在检出的真菌中以条件致病菌为主，没有发现致病性强的真菌，究其原因可能是：(1)抗生素及肾上腺皮质激素的应用使强致病菌检出率减少；(2)应用局部抗生素治疗CSOM后外耳道深部温暖湿润，适宜真菌生长，由于这种真菌感染是继发的，因此检出真菌以条件致病菌多见。对于经长期抗菌治疗后不愈，或伴糖尿病、结核等消耗性疾病有机会感染可能的CSOM患者应尽早行病原菌培养及药敏试验，尽可能早的发现耳真菌感染。

1.4 混合感染 CSOM病原菌感染常表现为多种病原菌的混合感染，其中以多种需氧菌混合感染、需氧菌与厌氧菌混合感染多见。Moyse等[22]及Heikkinen等[23]报道，病毒感染可引起CSOM，且病毒也可与其他病原菌混合感染，并认为这可能是CSOM久治不愈的原因之一。在混合感染中不同时期或使用抗菌药物后病原菌组成及比例可发生变异。其原因可能为：(1)不同时期耳内局部环境可发生改变，随着耳内环境的改变引起CSOM的病原菌可发生改变；(2)随着抗生素的广泛应用，病原菌耐药性逐渐增强，且其后代也携带耐药基因。因此，在CSOM混合感染中使用抗生素后耐药菌存活，非耐药菌被消灭，使其病原菌组成发生改变。Mozafari等[24]在12.9%的CSOM患者脓液培养中发现混合菌生长，试验中由于病原菌检测条件的限制，仅对需氧菌进行培养。该学者认为CSOM中混合感染率远不止如此。因此，在临床上治疗混合感染的CSOM时，应尽可能的考虑到各菌种的药物敏感性，选用最合适的抗菌药物。

2 CSOM病原菌检测方法

2.1 传统培养方法 目前CSOM标本病原菌检测绝大多数是采用传统培养方法。近几十年来国内外报道的CSOM病原菌培养结果存在较大差异，主要表现在菌群分布、培养阳性率及药物敏感等方面。这种差异也可能与传统培养方法本身有关：一是敏感性低，传统培养法要求培养的标本中病原菌达到一定的量且需要有活性的病原菌，当标本病原菌含量低时，培养假阴性率较高；二是易受细菌营养要求及抗生素使用的影响，对培养条件要求较高的病原菌(如：肺炎链球菌、流血嗜血杆菌、厌氧菌等)及患者近期使用过抗生素，传统培养法假阴性率较高；三是不能用于新菌种的鉴定。传统培养法的这些缺陷使其越来越不能满足临床要求，从而探索一种新的快速、准确、经济的病原菌检测技术显得尤为迫切。

2.2 以PCR技术为代表的新型病原菌检测方法 20世纪90年代以来，随着分子生物学及生物化学的飞速发展，分子诊断技术被广泛应用于临床上病原菌检测。其中聚合酶链式反应(polymerase Chain Reaction，PCR)是目前病原菌检测中一项非常重要的技术，该技术检测病原菌是基于DNA序列特异性扩增及DNA片段分析鉴定菌株的方法，其具有操作简便、快捷、敏感度高、特异性好、适用样品要求低等优点，且该技术不需要活菌和适宜的培养基[25-26]。具体表现如下：(1)对于难培养或生长缓慢的病原菌鉴定，PCR法较目前其他方法对其检出率高，对这类病原菌检测具有重要意义；(2)对于形态不典型、生化反应不典型及死亡的病原菌，应用PCR也能对标本中的病原菌作出准确鉴定；(3)处理混合感染标本时PCR技术也具有较大优势。CSOM混合感染率较高，尤其以需氧菌与厌氧菌混合感染常见。若用传统培养法处理此类标本，由于培养条件的差异所消耗的人力、物力将成倍的增加。

2.3 应用PCR技术检测病原菌的国内外动态 早在1997年国外学者Panu等[27]应用PCR技术检测分泌性中耳患者中耳分泌物标本中的病原菌，与传统细菌培养结果比较发现PCR技术能检出更精确的细菌谱，且该技术更精确、快捷，在临床应用中较传统培养方法更有优势。Keech等[28]应用PCR技术检测慢性鼻-鼻窦炎(chronic Rhinosinusitis，CRS)64份CRS标本中需氧菌的研究发现，PCR检出需氧菌阳性率为62%，主要包括表皮葡萄球菌(39%)、化脓性链球菌(17%)、流感嗜血杆菌(16%)、卡他莫拉菌(13%)、金黄色葡萄球菌(5%)和肺炎链球菌(3%)。而同期传统培养法阳性率为50%，主要包括表皮葡萄球菌(30%)、卡他莫拉菌(6%)、金黄色葡萄球菌(3%)和肺炎链球菌(5%)，未检测出流血嗜血杆菌和化脓性链球菌生长。结论指出PCR法能检出更精确的细菌谱，是一种可靠的检测工具，有助于CRS中病原菌的检测。亦有学者将PCR技术应用于真菌的检测，Kim等[29]应用普通真菌培养方法与真菌通用引物PCR技术检测急性中耳炎和分泌性中耳炎中耳分泌物标本中真菌的研究中发现，普通真菌培养阳性率(0/29)明显低于PCR检测结果(10/29，34%)，表明PCR检测敏感性高于普遍真菌培养。目前PCR技术应用于CSOM病原菌检测的研究尚未见报道。CSOM病原菌谱复杂且混合感染较为常见，传统培养只能就某一类病原菌作出鉴定，不能更全面的满足临床治疗需要。若将PCR技术应用于CSOM病原菌检测中，可以快速、准确检测出CSOM感染的病原菌，对临床治疗具有重要指导作用。

3 CSOM抗菌药物合理应用

加强CSOM规范抗炎治疗，对于单纯型CSOM患者可起到控制感染、早日干耳，甚至治愈的作用；对于病变较重的CSOM患者，不仅可以控制感染、避免并发症的产生，为手术治疗做好铺垫，还可以减少术后感染，促进术后干耳。目前，临床上应用于CSOM的局部抗生素有限，自20世纪90年代开始喹诺酮类滴耳液(如0.3%氧氟沙星滴耳液、盐酸洛美沙星滴耳液、诺氟沙星滴耳液)成为临床一线用药，其次还有利福平滴耳液、庆大霉素滴耳液等[30]。对于氨基糖甙类抗生素滴耳液有耳毒性，在临床上限制局部应用。细菌对抗菌药物产生耐药主要机制为细菌在体内产生针对抗菌药物的灭活酶，使药物到达作用位点前灭活或者被分解。其中β-内酰胺酶为最常见的灭活酶，该酶可使青霉素及头孢菌素类抗生素失活，临床中对于产生该酶的菌株应选用喹诺酮类或氨基糖甙类抗生素治疗。目前CSOM中病原菌对青霉素类、第一代头孢类抗生素(如头孢唑啉)敏感性较低，对喹诺酮类抗生素敏感性较高，对万古霉素及亚胺培南的敏感性几乎达100%[31]。因此青霉素、第一代头孢类药物不宜用作CSOM首选抗生素，而万古霉素及亚胺培南虽然敏感但价格昂贵也不宜作为首选药，常用于治疗严重感染及久治不愈病例。对于考虑厌氧菌感染或者混合感染，可适当加用抗厌氧菌药物(如：甲硝唑)联合抗感染；对于真菌感染的病例，可加用抗真菌药物(如：伊曲康唑)治疗，均可起到较好的治疗效果。

4 结语

近年来随着抗生素广泛使用，CSOM病原菌耐药率逐年增高，增加了CSOM的治疗时程及并发症发生率。应加强CSOM的规范化诊疗，规范用药指征，减少经验用药；在CSOM患者使用抗生素之前，确定病原菌种类及明确其药物敏感性，让CSOM患者尽早得到有效的治疗，对提高手术治愈率及降低并发症具有重要意义。在CSOM中我们除了应重视需氧菌感染，还需重视厌氧菌、真菌及混合感染。CSOM病原菌检测时传统培养方法与PCR检测方法联合应用，可提高病原菌检出率有助于预测CSOM患者病原菌种类。

[1]Baike EV.The comparative analysis of the clinical and morphological picture of the various forms of chronic suppurative otitis media [J].Vestn Otorinolaringol,2016,81(2):30-33.

[2]Verhoeff M,ven der Vern EL,Rovers MM,et al.Chronic suppurative otitis media:A review[J].Int Journal of Pediatric Otorhinolaryngology,2006,70(1):1-12.

[3]Coates HL,Morris PS,LeachAJ,et al.Otitismedia in Aboriginal children:tackling a major health problem[J].Med J Aust,2002,177(4): 177-178.

[4]Lasis AO,Olabiyan FA,Muibi SA,et al.Clinical and demographic risk factors with chronic supprative ototis media[J].Int J Pediar Otorthinolaryngol,2007,71(71):1549-1554.

[5]官文君,李朝军.慢性化脓性中耳炎细菌学研究进展[J].重庆医学, 2015,44(6):842-844.

[6]Lieu JE,Muthappan PG,Uppaluri J,et al.Association of reflux with otitis media in children[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2005,133 (2):357-361.

[7]Roland PS.Chronic suppurative otitis media:a clinical overview[J]. Ear Nose Throat,2002,81(1):8-10.

[8]顾兴智,牛良军,尤乐都斯·克尤木,等.新疆地区慢性化脓性中耳炎及中耳胆脂瘤病原菌及药敏分析[J].听力学及语言疾病杂志, 2014,22(5):489-493.

[9]熊观霞,白晶,吴旋,等.慢性化脓性中耳炎的细菌学监测和药物敏感性动态分析[J].中山大学学报(医学科学版),2012,33(2): 228-234.

[10]Orji FT,Dike BO.Observations on the current bacteriological profile of chronic supperative otitis media in south eastern nigeria[J].Ann Med Health Sci Res,2015,5(2):124-128.

[11]Ahn JH,Kim MN,Suk YA,et al.Preoperative,inteaoperative,and postoperative results of bacterial culture from patient with chonic suppurative otitis media[J].Otol Neurotol,2012,33(1):54-59.

[12]胡晓东.胆脂瘤型中耳炎细菌检测及耐药性分析[J].中国实用医药,2014,9(21):166-167.

[13]Testa AC,Timmerman D,Belle VV,et al.Intravenous contrast ultrasound examination using contrast tuned imaging(CnTI)and the contrast medium SonoVue for discrimination between benign and malignant adnexal masses with solid components[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2009,34(9):699-710.

[14]Rajat P,Deepak J,Vikrant N,et al.Microbiology of chronic suppurative otitis media in a tertiary care setup of Uttarakhand State,India [J].North American Journal of Medical Sciences,2013,5(4): 282-287.

[15]Chirwa M,Mulwafu W,Aswani JM,et al.Microbiology of chronic suppurative otitis media at Queen Elizabeth Central Hospital,lantyre, Malawi:A cross-sectional descriptive study[J].Malawi Medical Journal,2015,27(4):120-124.

[16]Yeo SG,Park DC,Hong SM,et al.Bacteriology of chronic suppurative otitis media-a multicenter study[J].Acte Otolaryngol,2007,127 (10):1062-1067.

[17]李双兴.慢性化脓性中耳炎厌氧菌的培养与药敏结果分析[J].中国医药导报,2010,7(33):130-130.

[18]Wintermeyer SM,Nahata MC.Chronic suppurative otitis media[J]. Ann Pharmacother,1994,28(9):1089-1099.

[19]Itzhak B.The role of anaerobic bacteria in chronic suppurative otitis media In children:Implications for medical therapy[J].Anaerobe, 2008,14(6):297-300.

[20]Schrader N,Isaacson G.Fungal otitis externa--its association with fluoroquinolone eardrops[J].Pediatrics,2003,111(5):1123-1128.

[21]Stern JC,Hah MK,Lucente FE,et al.In vitro effectiveness 13 agents in otomycosis and review of the literature[J].Laryngoscope,1998, 98(11):1173-1176.

[22]Moyse E,Lyon M,Cordier G,et a1.Viral RNA in middJe ear mucosa and exudates in patients with chronic otitis medja with effusion[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2000,126(9):1105-110.

[23]Heikkinen T,Chonmaitree T.ViraI-bacteriaI synergy in otitis media implications for management[J].Curr Infect Dis Rep,2000,2(2): 154-159.

[24]Mozafari Nia K,Sepehri G,Khatmi H,et al.Isolation and antimicrobial susceptibility of bacteria fromchronic suppurative otitis media patients in Kerman,Iran[J].Iranian Red Crescent Medical Journal, 2011,13(12):891-894.

[25]Insa R,Marin M,Martin A,et al.Systematic use of universal 16S-rRNA gene polymerase china reaction(PCR)and sequencing for processing pleural effusions improves conventional culture techniques[J].Medicine,2012,91(2):103-110.

[26]赵爱兰,孟琼,白向宁,等.双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌stx1和stx2基因[J].临床检验杂志,2013,31(4):241-244.

[27]Panu H,Markkanen A,Ylikoski J,et al.Use of Multiplex PCR for simultaneous detection of four bacterial species in middle ear effusions [J].J Clin Microbiol,1997,35(11):2854-2858

[28]Keech DR,Ramadan H,Mathers P,et al.Analysis of aerobic bacterial strains found in chronic rhinosinusitis using the polymerase chain reaction[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2000,123(4):363-367.

[29]Kim EJ,Catten MD,Lalwani AK,et al.Detection of fungal DNA in effusion associated with acute and serous otitis media[J].Laryngoscope,2002,112(11):2037-2041.

[30]vanHasselt P,vanKregten E.Treatment of chronic suppurative otitis media with o fl oxacin in hydroxypropyl methylcellulose ear drops:a clinical/bacteriological study in a rural area of Pediatr[J].Otorhinolaryngol,2002,63(1):49-56.

[31]龙彬,韩淑贞,王玉杰,等.慢性化脓性中耳炎患者的病原菌特点及药敏分析[J].中国卫生检验杂志,2013,23(8):1993-1995.

Research of microbiology in chronic suppurative otitis media.

LAN Xian-bin1,PEN Shao-ping2.1.2014 Grade Graduate,Gannan Medical University,Ganzou 341000,Jiangxi,CHINA;2.Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Ganzou 341000,Jiangxi,CHINA

Chronic suppurative otitis media(CSOM)is one of the common diseases in the Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery.It is the irreversible chronic inflammation in the middle ear and the mastoid.Up to now,the etiology of the disease and the mechanism is not completely clear.Its etiology is complex,and its occurrence is related to a variety of factors,including infection,dysfunction of eustachian tube and immunologic inadequacy.Bacterial infection is one of the most important and direct exogenous pathogenic factors of CSOM.At present,with the wide use of antibiotics,the sensitivity of CSOM pathogenic bacteria to antibiotics is gradually decreased,and the composition of the pathogen is also changing.Therefore,detecting the pathogenic bacteria in CSOM and identifying its drug sensitivity as soon as possible is of great significance for clinical treatment of CSOM.This review summarizes the distribution and drug resistance of pathogenic bacteria of CSOM,pathogenic bacteria detection and rational use of antimicrobial agents, based on the relevant literatures at home and abroad in recent years.

Chronic suppurative otitis media(CSOM);Microbiology;Polymerase chain reaction(PCR)

R764.21

A

1003—6350（2017）03—0467—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.03.039

2016-06-22)

彭韶平。E-mail：psp666@126.com