彭瑛，冯莎莎，田刚，杨梅，邓正华，王开正

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

血浆microRNA-107和microRNA-99b-5p对精神分裂症的诊断价值

彭瑛，冯莎莎，田刚，杨梅，邓正华，王开正

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

目的 探讨血浆microRNA-107(miR-107)和microRNA-99b-5p(miR-99b-5p)对精神分裂症的诊断价值。方法 收集90例初诊精神分裂症患者(精神分裂症组)，90例双相情感障碍患者(双相情感障碍组)和90例体检健康者(健康对照组)。采用实时荧光定量PCR法检测各组血浆miR-107和miR-99b-5p；绘制受试者工作特征(ROC)曲线，采用logistic回归分析法评价血浆miR-107和miR-99b-5p对精神分裂症的诊断价值。结果 精神分裂症组血浆miR-99b-5p和miR-107表达低于双相情感障碍组及健康对照组(P均<0.05)。miR-99b-5p和miR-107诊断精神分裂症的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.923、0.744，特异性分别为91.1%、62.2%，灵敏性分别为81.7%、75.0%；二者联合诊断的AUC为0.763，灵敏性和特异性分别为81.1%、87.2%。结论 miR-99b-5p是精神分裂症良好的生物学标志物，miR-107诊断效果不及miR-99b-5p。

精神分裂症；microRNA-107；microRNA-99b-5p；联合诊断

精神分裂症是一种由多个细胞信号通路异常调节所致的神经系统紊乱性疾病，包括多巴胺能信号、谷氨酸信号和神经可塑性信号通路异常等[1]。近年来精神分裂症的发病率逐年增加[2]。目前精神分裂症的诊断仍然依靠临床症状，缺乏特异性生物标志物。近年来研究发现，microRNA(微小RNA，miRNA)在精神分裂症的病理生理过程中发挥重要作用。由于循环miRNAs具有稳定性强、操作方便和患者已接受等优点，更具有研究价值。本研究观察精神分裂症患者血清miR-99b-5p和miR-107表达，进一步分析miRNAs与精神分裂症的关系及其诊断价值，旨在为精神分裂症的诊断提供灵敏、特异的实验室指标。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年10月～2015年10月在西南医科大学附属医院精神科初诊为精神分裂症的患者90例(精神分裂症组)，其中男49例、女41例，年龄12～63(30.1±12.8)岁。纳入标准：①根据美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSM-V)诊断为精神分裂症；②首次发病，未使用任何抗精神病药物。排除标准：①患有其他精神疾患或药物成瘾者；②曾有脑部外伤致应激性失忆症持续超过24 h者；③智力迟缓(IQ<70)者；④患运动障碍性疾病或电惊厥治疗(6个月以内)者；⑤孕产妇。选择同期90例诊断为双相情感障碍患者(情感障碍组)，其中男41例、女49例，年龄18～65(33.2±13.1)岁。纳入标准：①DSM-V诊断为双相情感障碍，未使用任何抗精神病药物。排除标准：同精神分裂症组。选择90例同期西南医科大学附属医院门诊体检中心的体检健康者(健康对照组)，自愿参与实验；其中男43例、女47例，年龄20～51(30.1±6.11)岁。以上三组均为汉族人，样本收集经本院伦理委员会批准，精神科医师和护士协助采集，患者本人或家属对研究内容知情同意并签署知情同意书。

1.2 血浆miR-99b-5p和miR-107表达检测 各组均抽取清晨空腹静脉血10 mL，EDTA-K2抗凝，3 000 r/min离心10 min。收集血浆于1.5 mL收集管中，再用离心力为16 000 g的高速冷冻离心机离心10 min，取上清移至另一收集管中，-80 ℃保存待用。血浆外参基因的制备：由于血浆中没有稳定表达的内参基因，本试验采用秀丽隐杆线虫miR-39所制成的miRNAs合成物(C. elegans miR-39 miRNA mimic)作为外参基因，在提取过程中保证所有血浆样本加入等量的该外参基因，以一管含量为10 pmol冻干粉的形式提供，按说明书进行稀释制备外参基因。采用实时荧光定量PCR法检测血浆miR-99b-5p和miR-107表达。血浆总RNA的提取和纯化：按照说明书进行总RNA的提取和纯化，对所有提取的RNA进行光密度(OD)值检测，OD值在1.8～2.0之间说明纯度较好，琼脂糖电泳后再凝胶成像仪下进行完整性分析。OD值检测结果显示，本实验所得的RNA提取物的纯度较好(OD值为1.4～2.0)；琼脂糖电泳后在凝胶成像仪下可见两条清晰的28S和18S条带，证实所提取的RNA具有较好的完整性。RNA反转录成cDNA：准备反转录体系，5×miScript HiSpec Buffer 4 μL，10×miScript Nucleics Mix 2 μL，无RNA酶水7 μL，miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μL，样本RNA 5 μL，总体积 20 μL。按95 ℃ 反应5 min，37 ℃反应60 min进行反转录及扩增成cDNA。加入180 μL无RNA酶水稀释cDNA，分装保存。qRT-PCR反应：准备qRT-PCR反应混合液于96孔反应板中，2×QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix 10 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，10×miScript Primer Assay(引物)2 μL，无RNA酶水4 μL，模版DNA 2 μL，总体积20 μL。PCR扩增循环条件：90 ℃，15 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，70 ℃、30 s，共40个循环。ΔCt值为目的基因与外参基因Ct值之差，即(ΔCt=CtmiRNA-Ct外参)，以2-ΔCt代表各样本miRNAs的相对表达量。

1.3 MiR-99b-5p和miR-107诊断精神分裂症的效能分析 采用受试者工作特征(ROC)曲线和logistic回归分析评价血浆miR-99b-5p和miR-107及二者联合检测对精神分裂症的诊断效能。在ROC曲线下面积(AUC)>0.50的情况下，AUC值越大，越接近于1，诊断准确性越高[3]。

2 结果

2.1 血浆miR-99b-5p和miR-107表达 三组血浆miR-99b-5p和miR-107表达比较见表1。

表1 三组血浆miR-99b-5p和miR-107相对表达量比较±s)

注：与健康对照组比较，*P<0.01；与双相情感障碍组比较，△P<0.01。

2.2 miR-99b-5p和miR-107对精神分裂症的诊断价值 miR-99b-5p和miR-107诊断精神分裂症的AUC分别为0.923、0.744，特异性分别为91.1%、62.2%，灵敏性分别为81.7%、75.0%；二者联合检测诊断的AUC为0.763，灵敏性和特异性分别为81.1%、87.2%。见图1。

图1 miR-99b-5p和miR-107诊断精神分裂症的ROC曲线

3 讨论

miRNA是一类长度21～25核苷酸片段的内源性非编码的小分子RNA[4]，与生长发育、器官形成、细胞增殖凋亡、肿瘤形成和天然免疫等病理生理过程有关[5]。中枢神经系统含有非常丰富的miRNAs，在神经细胞的增殖、发育、分化和突触塑形等方面起重要作用[6]。miRNA在血清(浆)中广泛稳定的存在，并随生理状况、疾病的种类而变化[7]。

研究发现，miR-107在调节N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体诱导的钙信号通路中有重要作用[8]。miR-107在精神分裂症患者的背外侧前额叶皮层上调，对NMDA受体亚基3A的非编码区3′端有较强的调节作用，在参与神经连接和突触可塑性的通路中高度富集，如轴突导向、长时程增强作用等[9]。Scarr等[10]研究发现，大脑颞上回皮层灰质区miR-107表达上调、miR-107可调控CHRM1基因表达。进一步说明miR-107参与了精神分裂症的发病。目前尚缺乏miR-99b-5p与精神分裂症的相关报道，但研究发现，miR-99家族在调节细胞存活、细胞应激反应、细胞增殖、血管生成、DNA损伤和伤口愈合等生理过程中发挥重要作用[11]。生物信息学分析发现，miR-99b-5p调控的直接靶基因包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)[12]；而mTOR与调节神经元的存活、神经保护、细胞自噬、突触发育和功能神经系统以及和突触重塑、长时程增强记忆和认知能力下降等有关[13,14]。精神分裂症是以多种临床症状和认知缺陷为特征的一种复杂的神经紊乱性疾病，涉及到神经网路和突触功能的紊乱；据此分析miR-99b-5p也可能参与了精神分裂症的发生。

目前尚缺乏精神分裂症患者外周血miR-99b-5p和miR-107表达的相关研究。本研究miR-107和miR-99b-5p在精神分裂症患者血浆中均呈低表达，二者可能与精神分裂症发病机制存在着某些关联，值得进一步探讨。本研究统计分析发现，miR-99b-5p对精神分裂症有较高的诊断价值，敏感性、特异性、准确性均高于miR-107。但多项研究均证实了miR-107与精神分裂症有密切关系，Gardiner等[15]在精神分裂症的外周血单个核细胞中发现miR-107低表达，本研究结果与其基本一致。miR-107低表达的可能机制为miRNA具有游走性[16]，从病变组织、器官释放的miRNA可能先入血，再入外周血单核细胞。本研究miR-107诊断精神分裂症的AUC虽低于miR-99b-5p，但仍存在诊断意义。研究发现，采用多个miRNAs对疾病状态的预测精度高于单一的miRNA[17]。本研究对低表达miR-107、miR-99b-5p的定量资料进行联合logistic回归分析发现，二者联合检测诊断精神分裂症的特异性、敏感性及AUC均高于miR-107单项检测，说明联合检测可提高miR-107的诊断能力。本研究的不足之处：由于时间和经费的限制，样本量偏少、研究对象范围较小；只选择了双相情感障碍作为对照，抑郁症等其他精神疾病未纳入研究，故不能排除其他精神疾病患者亦存在miRNA的差异表达。今后的研究中将进一步扩大样本量，进行循环miRNAs生物标志物诊断模型研究和特征miRNAs功能验证试验，以更深层次的阐明其在精神分裂症中的作用机制。

[1] Picchioni MM, Murray RM. Schizophrenia[J]. BMJ, 2007,335(7610):91-95.

[2] Andreasen NC, Carpenter WT Jr. Diagnosis and classification of schizophrenia[J]. Schizophr Bull, 1993,19(2):199-214.

[3] 李晓松.医学统计学[M].2版.北京:高等教育出版社,2008:205-235.

[4] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004,116(2):281-297.

[5] Johnson SM, Grosshans H, Shingara J, et al. RAS is regulated by the et-7 miRNA family[J].Cell, 2005,20(5):635-647.

[6] 王汨,陆邵佳,李凌江.microRNA在双相情感障碍中的研究进展[J].中国神经精神疾病杂志,2012,38(10):635-637.

[7] Mitchell PS, Parkin PK, Kroh EM, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J]. PNAS, 2008,105(30):10513-10518.

[8] Miller BH. Wahlestedt C. MicroRNA dysregulation in psychiatric disease[J]. Brain Res, 2010(1338):89-99.

[9] Beveridge NJ, Gardiner E, Carroll AP, et al. Schizophrenia is associated with an increase in cortical microRNA biogenesis[J]. Mol Psychiatry, 2010,15(12):1176-1189.

[10] Scarr E, Craig JM, Cairns MJ, et al. Decreased cortical muscarinic M1 receptors in schizophrenia are associated with changes in gene promoter methylation, mRNA and gene targeting microRNA[J]. Transl Psychiatry, 2013(3):e230.

[11] Mueller AC, Sun D, Dutta A. The miR-99 family regulates the DNA damage response through its target SNF2H[J]. Oncogene, 2013,32(9):1164-1172.

[12] Li W, Chang J, Wang S, et al. miRNA-99b-5p suppresses liver metastasis of colorectal cancer by down-regulating mTOR[J]. Oncotarget, 2015,6(27):24448-24462.

[13] Heras-Sandoval D, Perez-Rojas JM, Hernandez-Damian J, et al. The role of PI3K/AKT/mTOR pathway in the modulation of autophagy and the clearance of protein aggregates in neurodegeneration[J]. Cell Signal, 2014,26(12):2694-2701.

[14] Ma T, Hoeffer CA, Capetillo-Zarate E, et al. Dysregulation of the mTOR pathway mediates impairment of synaptic plasticity in a mouse model of Alzheimer′s disease[J]. PLoS One, 2010,5(9):e12845.

[15] Gardiner E, Beveridge NJ, Wu JQ, et al. Imprinted DLK1-DIO3 region of 14q32 defines a schizophrenia-associated miRNA signature in peripheral blood mononuclear cells[J]. Mol Psychiatry, 2012,17(8):827-840.

[16] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004,116(2):281-97.

[17] Tsuang MT, Nossova N, Yager T, et al. Assessing the validity of blood-based gene expression profiles for the classification of schizophrenia and bipolar disorder: a preliminary report[J]. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 2005,33B(1):1-5.

王开正(E-mail： 1136365404@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.034

R749

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1002-266X(2017)04-0098-03

2016-06-26)