孟祥潮，蔡准，陈国福，吴丽君，张雪鹏

(华北理工大学附属医院，河北唐山 063000)

ADAM17-shRNA对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及机制

孟祥潮，蔡准，陈国福，吴丽君，张雪鹏

(华北理工大学附属医院，河北唐山 063000)

目的 探讨解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)-短发夹RNA(shRNA)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其可能机制。方法 将MCF-7细胞分为无义序列组、对照组、转染组。针对ADAM17基因设计合成4个特异性ADAM17-shRNA(ADAM17-shRNA-1219、ADAM17-shRNA-1508、ADAM17-shRNA-1134、ADAM17-shRNA-297)，采用电穿孔法转染MCF-7细胞：无义序列组转染无义序列ADAM17-shNC，转染组分别转染ADAM17-shRNA序列ADAM17-shRNA-1219、ADAM17-shRNA-1508、ADAM17-shRNA-1134、ADAM17-shRNA-297。对照组加入空白PBS，分别采用利用Real-time PCR、Western blotting法、iCELLigence法及流式细胞仪检测各组ADAM17 mRNA表达水平、ADAM17蛋白表达情况、细胞生长曲线和增殖活性及细胞周期变化。结果 4个ADAM17-shRNA序列对MCF-7细胞的ADAM17基因表达均有抑制作用，以shRNA1219载体的抑制效率最高，与对照组和无义序列组比较差异均具有统计学意义(P均<0.05)；转染组ADAM17 mRNA及蛋白的表达水平明显低于无义序列组和对照组(P均<0.05)；转染组细胞增殖活性和细胞生长速度较无义序列组和对照组均显著降低(P均<0.05)；转染组细胞进入S期和G2/M期的比例降低，绝大多数细胞停留在G0/G1期，与对照组、无义序列组比较差异显著(P均<0.05)。结论 ADAM17-shRNA可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖活性，机制与其对ADAM17基因具有沉默作用有关。

乳腺癌；解聚素-金属蛋白酶17；转染；RNA干扰；增殖

解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)又称为肿瘤坏死因子α-转化酶(TACE)，其具有解聚素和金属蛋白酶的蛋白活性。ADAM17发挥蛋白酶剪切样的作用，可以激活或释放多种结构和功能不同的生物活性分子，从而调节细胞增殖、侵袭、运动能力等多种细胞生物学行为[1]。近年研究表明，ADAM17在多种恶性肿瘤中都有表达，而在正常组织和细胞中却很少表达，从而参与肿瘤的发生、增殖、侵袭和转移的过程[2～5]。RNA干扰(RNAi)是近年来新发现的一项基因沉默技术，本课题通过利用RNA干扰技术来沉默乳腺癌MCF-7细胞ADAM17基因的表达，观察其对乳腺癌细胞增殖能力的影响，为乳腺癌的基因靶向治疗提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7细胞系购置于中国医学科学院天津血液研究所；TRIzol、M-MLV逆转录试剂盒、PIatimum SYBR PCR试剂盒均由Invitrogen公司提供；兔抗鼠ADAM17、兔抗鼠β-actin购置英国Abcam公司；ADAM17-shRNA(ADAM17-shRNA-1219、ADAM17-shRNA-1508、ADAM17-shRNA-1134、ADAM17-shRNA-297)和ADAM17-shNC载体购买于上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 细胞培养及转染 将人乳腺癌MCF-7细胞用含有10% FBS、1%青链霉素混合液的DMEM培养基(高糖)，并置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中进行细胞培养。实验分为对照组、无义序列组和转染组，每组细胞数量控制在1×106个细胞。采用电穿孔法转染细胞：吸取20 μL Opti-MEM I悬浮细胞；将电击杯中添加5 μL ADAM17-shRNA载体，加入质粒。充分混匀悬浮细胞，上机操作。设置CUY21 EDIT Ⅱ细胞电转化仪的输出电压(125 V)、脉冲宽度(10 ms)和电转时间(1 min)，电处理结束后，加入完全培养液，于细胞孵箱中常规培养。转染组加入转染剂及ADAM17-shRNA(ADAM17-shRNA-1219、ADAM17-shRNA-1508、ADAM17-shRNA-1134、ADAM17-shRNA-297)，相同的方法转染对照组和无义序列组，对照组添加与转染试剂和ADAM17-shRNA载体总量相等的空白PBS，无义序列组添加转染剂和无义序列ADAM17-shNC载体。转染48 h置于荧光显微镜下观察转染效率，结果显示转染组转染效率为90%以上(见插页Ⅰ图1)。证实ADAM17-shRNA转染成功。

1.3 ADAM17-shRNA沉默ADAM17基因效果观察 细胞转染后常规培养48 h，收集各组细胞，经TRIzol试剂说明书一步法提取总RNA，测定总RNA的纯度和浓度符合实验要求后采用M-MLV试剂盒合成cDNA，PIatimum SYBR试剂盒进行PCR扩增反应，根据PCR的引物序列：β-actin内参引物序列：上游5′-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3′，下游5′-TTCTTTCCCACATTGCGTTGATTC-3′；ADAM17引物序列：上游5′-ATCAAACCCTTTCCTGCG-3′，下游5′-CAAACCCATCCTCGTCCA-3′；48 h后采用Real-time PCR法检测各组ADAM17 mRNA表达情况，采用相对定量法(CT法)进行数据分析，ADAM17 mRNA相对表达量=2-ΔΔCT。筛选出沉默ADAM17基因效率(细胞抑制率)最高的shRNA用于后续实验。结果显示无义序列组ADAM17 mRNA相对表达量为0.95±0.11，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；转染组转染shRNA-297、shRNA-1134、shRNA-1219、shRNA-1508后ADAM17 mRNA的相对表达量分别为0.74±0.25、0.61±0.06、0.51±0.18、0.53±0.37，与对照组及无义序列组比较均明显降低，以shRNA1219的细胞抑制率最高(P均<0.05)；即其ADAM17基因沉默效率最高。后续实验中转染组均转染shRNA1219。

1.4 相关指标观察

1.4.1 细胞ADAM17蛋白表达 采用Western blotting法。各组细胞转染后分别用预冷的PBS冲洗3次，滴加150 μL细胞RIPA裂解液，4 ℃冰浴裂解20 min，使用细胞刮刮取细胞裂解碎片，收集于EP管中，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，采用Bradford法测定总蛋白浓度，各组样品取35 μg蛋白质/泳道，进行凝胶电泳，配制5%的浓缩胶和10%的分离胶，电泳90 V电压至出现红色Marker，调电压至120 V，继续进行电转，冰水浴条件下，设置250 mA、90 min将凝胶中蛋白转移至PVDF膜；滴加100 μL一抗ADAM17(1∶1 000)，一抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃过夜；TBST 10 min洗3次；加相应二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1.5 h；TBST洗膜10 min共洗3次。使用ECL发光剂显色，凝胶成像系统扫描条带，Image J软件分析光密度(OD)值。

1.4.2 细胞增殖情况 采用iCELLigence系统行细胞增殖检测：取出E-Plate L8，每孔中加入混合均匀250 μL的三组细胞悬液，置于常温下30 min，最后将E-Plate L8放到CO2细胞培养孵箱中的iCELLigence 上进行培养。系统会每隔10 min检测细胞的贴壁黏附情况、生长和增殖过程，传感器检测获得的细胞阻抗参数用细胞指数(CI)表示，采用iCelligence DA 软件2.0进行实验数据分析和实验图像处理。

1.4.3 细胞周期 细胞转染后继续培养48 h，收集各组细胞，加入预冷的70%乙醇2 mL充分悬浮细胞，4 ℃固定24 h以上。细胞固定好后，重悬细胞，添加100 μg/mL碘化丙啶染液200 μL，常温下避光染色30 min。使用300钼滤网过滤细胞悬液，采用流式细胞仪细胞周期ModFit软件处理实验结果。

2 结果

2.1 ADAM17蛋白表达 对照组、无义序列组及转染组ADAM17蛋白的相对表达量分别为0.615±0.021、0.612±0.023、0.478±0.028，转染组均明显低于无义序列组及对照组(P均<0.01)，对照组与无义序列组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组ADAM17蛋白表达

2.3 细胞生长曲线及细胞增殖活性 经iCelligence DA 软件1.0处理分析后得到细胞生长曲线，见插页Ⅰ图2。对照组、无义序列组和转染组的CI分别为6.22、6.19和3.12。无义序列组与对照组细胞的生长速度和及增殖活性比较差异无统计学意义(P>0.05)；但与无义序列组和对照组比较，转染组细胞增殖活性明显降低，生长速度明显减慢(P<0.05)。

2.4 细胞周期 转染组G0/G1期细胞比例均显著高于无义序列组与对照组，处于S期和G2/M期的细胞比例均显著低于无义序列组与对照组(P均<0.05)；无义序列组与对照组相比较无统计学差异(P>0.05)；见表1。

3 讨论

近年来乳腺癌的发病率逐年攀升，占女性恶性肿瘤死因的首位[6]。全球范围内每年超过100万妇女被诊断患有乳腺癌，占女性癌症病例的23%[7]。

表1 各组细胞周期细胞比例±s)

注：与对照组及无义序列组比较，*P<0.05。

在我国乳腺癌发病率每年正以2%的速度增长[8]。ADAM17是一种被发现的具有蛋白剪切酶样作用的膜蛋白基因，通过蛋白剪切酶样作用调节如增殖、运动能力等多种细胞生物学行为[9,10]。ADAM17可通过表皮生长因子受体(EGFR)等多种途径促进肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖及侵袭转移等生物学行为[11]。近年来ADAM17在乳腺癌中的作用越来越受到关注[12～14]。研究发现，ADAM17可通过EGFR-PI3K-AKT信号通路促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移[15]；可通过激活双调蛋白来促进乳腺癌的发生和发展[16]；乳腺癌患者淋巴结转移数目与ADAM17的高表达呈现出正相关，ADAM17在乳腺癌中的高表达可增加乳腺癌细胞的增殖和侵袭转移能力[17]。 采用免疫组化法检测发现ADAM17在正常乳腺组织中少量表达或不表达，在乳腺纤维腺瘤组织中少量表达，但高于正常乳腺组织，而在浸润性乳腺癌组织中均呈高表达状态[18]。此外，ADAM17表达强度与腋窝淋巴结转移状况存在正相关性。原庆会等[19]发现在乳腺癌组织中ADAM17 mRNA及蛋白表达水平与临床病理分期密切相关，ADAM17表达越高，TNM分期越差，ADAM17蛋白表达水平与TNM分期呈正相关。上述均提示ADAM17在乳腺癌的发生、发展的整个进程中起到了极其重要的促进作用，极有可能为乳腺癌基因靶向治疗的一个新靶点。

RNAi技术是一种有效的特异性抑制靶基因功能的实验技术[20]。其原理是促进靶基因转录产物mRNA的降解，或在某些情况下阻止靶基因的转录，或防止mRNA翻译成相应的蛋白质[21]。彭晓兵等[22]研究发现，转染ADAM17-shRNA的骨髓间充质干细胞对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力有显著的抑制作用。钟玫等[23]利用shRNA沉默促进肝细胞再生磷酸酶3基因的表达，发现可抑制MCF-7细胞增殖并促进其凋亡。本课题组前期研究发现，ADAM17-shRNA在缺氧条件下可沉默人乳腺癌MCF-7细胞ADAM17基因表达，从而导致MCF-7细胞生长速度减慢，细胞增殖能力降低，细胞周期延缓[24]。本研究结果显示，电穿孔法转染MCF-7细胞的转染效率90%以上，四种ADAM17-shRNA序列对MCF-7细胞ADAM17 mRNA表达均有抑制作用，以shRNA1219沉默效率最高。转染组ADAM17蛋白表达水平明显低于无义序列组和对照组，MCF-7细胞生长速度、增殖活性及进入S和G2/M期的细胞比例明显低于对照组及无义序列组；绝大多数细胞停留在G0/G1期，与对照组、无义序列组比较差异显著。说明特异性ADAM17-shRNA表达载体能有效沉默ADAM17 mRNA和蛋白表达，抑制MCF-7细胞生长，延缓细胞周期进展，导致细胞增殖能力明显下降。

综上所述，ADAM17对人乳腺癌MCF-7细胞增殖中具有促进作用，ADAM17可作为乳腺癌基因治疗的靶点；RNAi技术可实现对MCF-7细胞增殖的干预。今后的研究将针对ADAM17的ADAM17-shRNA在动物体内抑制乳腺癌细胞的生长情况开展。

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Effects of ADAM17-shRNA on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells

MENGXiangchao,CAIZhun,CHENGuofu,WULijun,ZHANGXuepeng

(AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the effect of a disintegrin and metalloprotease 17 (ADAM17)-shRNA on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and to explore its possible mechanism. Methods MCF-7 cells were divided into the nonsense group, control group (PBS) and transfection group. Four specific ADAM17-shRNAs (ADAM17-shRNA-1219, ADAM17-shRNA-1508, ADAM17-shRNA-1134 and ADAM17-shRNA-297) were designed and synthesized for ADAM17 gene. MCF-7 cells were transfected by electroporation. The nonsense group was transfected by ADAM17-shNC, the control group was added with PBS, and the transfection group was transfected by ADAM17-shRNA-1219, ADAM17-shRNA-1508, ADAM17-shRNA-1134 and ADAM17-shRNA-297, respectively. The expression of ADAM17 mRNA, the expression of ADAM17 protein, cell growth curve, proliferation activity and cell cycle of MCF-7 cells was respectively detected by real-time PCR, Western blotting, iCELLigence and flow cytometry. Results Four ADAM17-shRNA sequences inhibited the expression of ADAM17 gene, the shRNA1219 vector had the highest inhibitory efficiency, and compared with the nonsense group and control group, there was significant difference (allP<0.05). The expression level of ADAM17 mRNA and protein in the transfection group was significantly lower than that in the nonsense group and control group (allP<0.05). The cell proliferation activity and cell growth rate of the transfection group were significantly lower than those of the nonsense group and the control group (allP<0.05). The percentage of cells in S phase and G2/M phase decreased in the transfection group, and most of the cells stayed in G0/G1phase, which were significantly different from those in the control group and nonsense group (allP<0.05). Conclusion ADAM17-shRNA can inhibit the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells, and the mechanism is related to its silencing effect on ADAM17 gene.

breast carcinoma; a disintegrin and metalloprotease 17; transfection; RNA interference; proliferation

河北省自然科学基金资助项目(C2010001767)；唐山市科学技术研究与发展计划项目[唐科计(2014)16号]。

孟祥潮(1989-)，男，硕士，研究方向为乳腺癌基础与临床。E-mail： 13191777313@163.com

张雪鹏(1974-)，男，博士后，教授，主任医师，研究方向为乳腺癌基础与临床。E-mail： syzxp@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.004

R737.9

A

1002-266X(2017)04-0021-04

2016-06-08)