赵亚丽，苏超，甘世虎，任媛媛，高星杰，杨洁，何津岩

(天津医科大学，天津300070)

·论著·

人Tudor-SN UTR片段荧光素酶报告基因表达质粒的构建及活性检测

赵亚丽，苏超，甘世虎，任媛媛，高星杰，杨洁，何津岩

(天津医科大学，天津300070)

目的 为深入研究Tudor-SN蛋白本身在翻译水平的调控机制奠定基础。方法 以HeLa细胞全基因组DNA为模板，PCR扩增出目的基因，利用双酶切的方法将目的片段连接到pGL3-Control载体上。再将构建成功的pGL3-5′UTR、pGL3-3′UTR重组质粒分别与内参海肾荧光素酶质粒瞬时共转染HeLa细胞，培养48 h检测荧光素酶的活性。结果 双酶切和基因测序法鉴定重组质粒构建成功，转染重组质粒后可检测到荧光素酶的活性；以pGL3-5′UTR质粒荧光素酶活性最高。结论 成功构建了人Tudor-SN基因5′UTR和3′UTR序列的重组质粒，为研究Tudor-SN基因UTR区对翻译调控的影响奠定了基础。

人Tudor-SN蛋白；5′UTR；3′UTR；重组质粒；荧光素酶

Tudor-SN蛋白又常被称为SND1蛋白，该蛋白于1995年首次作为EB病毒细胞核抗原2(EBNA2)的转录调控激活因子被发现[1]。通过疏水簇结构域(HCA)分析可知，Tudor-SN蛋白由N端重复的4个葡萄球菌核酸酶类似物(SN)和C端的TSN片段组成[2]。近年研究发现，Tudor-SN多功能蛋白参与很多生物学行为，如细胞的应激反应[3]、脂代谢[4]，细胞周期调控[5]，pre-mRNA的剪切加工[6]和基因的表达调控[7]等。目前关于Tudor-SN蛋白自身表达调控的研究鲜见。2016年5～8月，本研究采用pGL3-Control质粒载体构建Tudor-SN UTR区域的荧光素酶重组质粒，旨在为深入研究Tudor-SN蛋白在翻译水平的调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 pGL3-Control萤火虫荧光素酶基因表达载体、双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶Hind Ⅲ、Nco Ⅰ、Xba Ⅰ、Hpa Ⅰ、T4 DNA Ligase购自Thermo公司；Lipofectamine® 2000购自Invitrogen公司；去内毒素质粒提取试剂盒、基因组DNA抽提试剂盒购自Omega公司，DNA快速胶回收提取试剂盒购自BIOMIGA公司；引物合成、基因测序由GENEWIZ公司完成；ONPG购自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基购自Hyclone公司；HeLa细胞、内参海肾荧光素酶质粒为本课题组保存。1.2 Tudor-SN基因5′UTR、3′UTR序列引物设计 利用NCBI、UCSC网站明确人Tudor-SN基因的5′UTR、3′UTR序列，设计引物：5′UTR上游引物：5′-CAAGCTTACGCTTGCGCGGCGAGTAG-3′，下游引物：5′-GCCATGGGTGTGGAGATGCAAAGGCA-3′；3′UTR上游引物：5′-CTCTAGAGGAGGGGATCGGGTTTGGCC-3′，下游引物：5′-GGTTAACTTTTTTTTTTTTTTTGATCAA-3′(上、下游引物中，加粗部分分别代表引入的酶切位点的序列，5′UTR：Hind Ⅲ和Nco Ⅰ，3′UTR：Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ)。以5′UTR、3′UTR序列片段构建质粒。为了更准确体现5′UTR和3′UTR序列的功能，我们模拟UTR在Tudor-SN基因中的位置，将5′UTR插入到Luc基因之前，3′UTR插入到Luc基因之后，相关模式图见图1。

图1 Luciferase质粒插入5′UTR和3′UTR片段的模式图

1.3 基因组DNA提取及目的片段5′UTR和3′UTR扩增 用基因组DNA提取试剂盒提取HeLa细胞的DNA作为PCR扩增模板，采用25 μL体系，扩增参数为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；33个循环，PCR循环完成后72 ℃再延伸5 min，4 ℃终止反应。取 PCR产物10 μL行1%的琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR扩增产物。预测扩增的人Tudor-SN基因的5′UTR目的片段长度为226 bp，3′UTR目的片段的长度为560 bp。

1.4 线性pGL3-Control载体的获取 用质粒小提试剂盒提取pGL3-Control 质粒DNA，分别用Hind Ⅲ和Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ进行双酶切，完整切下pGL3-Control 质粒载体，琼脂糖凝胶电泳。凝胶回收试剂盒回收得到约5 000 bp的线性pGL3-Control。1.5 重组质粒pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR构建、酶切鉴定及测序 需要构建的重组质粒pGL3-5′UTR是将5′UTR插入到pGL3-Control 质粒载体的Luc基因之前，Hind Ⅲ和Nco Ⅰ酶切位点之间，pGL3-3′UTR是将3′UTR插入到pGL3-Control质粒载体的Luc基因之后，Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ酶切位点之间，所以我们用Hind Ⅲ和Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ分别双酶切pGL3-Control质粒载体，其线性化后，切下目的条带，用凝胶回收试剂盒回收纯化酶切产物。将Tudor-SN的5′UTR、3′UTR目的片段与酶切的线性载体以3∶1的比例在T4 DNA连接酶的作用下室温反应60 min，取连接后的产物5 μL，加入到50 μL DH5α感受态细菌中弹匀，冰上静置15 min，42 ℃热激30 s，冰上冷激2 min，加入500 μL液体LB培基，37 ℃摇床孵育1.5 h，在含有氨苄霉素(25 μg/mL)的LB平板上涂布转化后的菌液，待液体吸收后，倒置于37 ℃生化培养箱过夜。连接产物的平板上有菌落长出后，挑取3个单克隆菌落，分别接种于含氨苄霉素(25 μg/mL)的20 mL液体LB培养基中，37 ℃摇床过夜。第二天提取质粒酶切鉴定，同时对菌液进行测序。

1.6 重组质粒pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR荧光素酶活性鉴定

1.6.1 重组质粒转染 用脂质体转染法将pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR分别与海肾荧光素酶表达质粒(内参)共转入HeLa细胞中(以24孔板为例)。具体步骤：①HeLa细胞融合度为60%时转染，转染前换成新鲜培基；②分别用25 μL无血清的opti-MEM培养液稀释质粒1 μg(内参质粒为250 ng)和转染试剂Lipofectamine®2000 2 μL，轻弹混匀室温静置5 min；③将稀释的质粒和Lipofectamine®2000混匀，室温静置15 min；④ 混悬液缓慢均匀加入含500 μL培养基的细胞孔中，摇匀；⑤正常培养48 h后收集样品，进行荧光素酶的活性检测。

1.6.2 荧光素酶活性检测 转染48 h后，弃去培基，用冷的1×PBS洗3次，弃干净；每孔加被动裂解液100 μL，室温慢摇20 min；将裂解液转移至离心管中，涡旋2次、每次10 s，10 000 r/min离心5 min，取上清至新的离心管中；取20 μL裂解液和100 μL LARII混匀，荧光发光计检测萤火虫荧光素酶的活性，然后向同一孔中加入等量的Stop & Glo®检测海肾荧光素酶的活性，每个实验做3个复孔。

2 结果

2.1 Tudor-SN的5′UTR和3′UTR PCR扩增结果 以HeLa细胞全基因组DNA为模板，用含酶切位点的引物进行PCR扩增，2%的琼脂糖胶电泳结果显示产物5′UTR(图2A)、3′UTR(图2B)在相应的位置有明显的条带，说明扩增出的目的条带与预期产物5′UTR 长度226 bp，3′UTR长度560 bp相符。

注：M为Trans2K DNA maker；1为5′UTR(226 bp)；2为3′UTR(560 bp)。

图2 线性目的片段5′UTR和3′UTR的获取

2.2 线性pGL3-Control载体的获取结果 用Hind Ⅲ和Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ分别双酶切pGL3-Control质粒载体后，1%的琼脂糖凝胶电泳分析线性化质粒载体，显示条带分别出现在约5 000 bp(图3A、B)，回收纯化该片段。

注：M为Trans2K Plus Ⅱ DNA maker；1为双酶切前；2为双酶切后。

图3 线性pGL3-Control载体的获取和鉴定

2.3 重组质粒pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR的构建、酶切鉴定及测序结果 在T4 DNA连接酶的作用下将纯化的线性质粒载体pGL3-Control和目的片段5′UTR、3′UTR分别进行连接，经过转化和扩增后再将构建的重组质粒pGL3-5′UTR用Hind Ⅲ、Nco Ⅰ双酶切，重组质粒pGL3-3′UTR用Xba Ⅰ、Hpa Ⅰ双酶切后鉴定。结果显示，质粒pGL3-5′UTR双酶切后，在200 bp左右(目的片段)与5 kb左右(载体片段)各切出一条带(图4A)，pGL3-3′UTR双酶切后，在500 bp左右(目的片段)与5 kb左右(载体片段)各切出一条带(图4B)，表明5′UTR、3′UTR已插入到pGL3-Control质粒载体中。同时，依据碱基互补配对原则，用pGL3-Control的通用引物(5′-CTAGCAAATAGGCTGTCCC-3′和5′-CTTTATGTTTTTGGCG TCTTCCA-3′)以重组质粒为模板，进行基因测序，测序结果证明目的片段成功插入到pGL3-Control载体中，说明萤火虫荧光素酶报告基因重组质粒构建成功。

注：M为Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker；1为双酶切前；2为双酶切后。

图4 重组质粒pGL3- 5′UTR 、pGL3-3′UTR 的双酶切鉴定

2.4 荧光素酶活性测定结果 将pGL3-5′UTR、pGL3-3′UTR重组质粒分别与内参海肾荧光素酶质粒共转染入HeLa细胞中，转染48 h后收样品，检测荧光素酶的相对活性分别为46.98±0.9和19.51±1.3。

3 讨论

Tudor-SN多功能蛋白高度保守且广泛存在于哺乳动物体内，参与很多生物学调控。一方面Tudor-SN蛋白可作为STAT6、E2F-1、PPARγ等基因的转录共激活因子参与基因的表达调控[5,8,9]。另一方面，Tudor-SN蛋白作为RNP的组成成分，可通过对一些基因pre-mRNA的剪切加工来发挥其表达调控作用[10～12]。后来的研究也揭示Tudor-SN蛋白通过促进肿瘤的增殖、侵袭和迁移能力，参与很多肿瘤的发生，比如前列腺癌[12]、乳腺癌[13]、肝癌[14]、肺癌[15]等。关于Tudor-SN蛋白的功能研究很多，但Tudor-SN蛋白自身表达调控的研究却不常见。Armengol等[16]课题组研究发现，转录调控因子NF-κB、Sp1和NF-Y可参与Tudor-SN基因转录水平的调控，而关于Tudor-SN蛋白翻译水平的调控目前尚无相关报道。

真核生物中涉及分化和发育的基因主要受mRNA的选择性翻译而调控，参与这种调节的序列大多群集于转录本的UTR，包括5′UTR和3′UTR。mRNA的5′UTR在基因表达的多个方面都做出了贡献，包括mRNA的加工、折叠，维持稳定性，细胞内的运输和定位以及增强翻译效率等。3′UTR的功能包括保护mRNA的稳定性，保护5′帽结构并控制mRNA的亚细胞定位。除了以上的正性调控以外，5′UTR和3′UTR对基因表达也存在负性调控，并且已知的许多与生长发育相关的基因都是通过UTR参与基因的翻译抑制。其中5′UTR对基因表达的负调控主要包括以下方面：5′UTR的序列中存在自身碱基配对时，可形成发卡式或茎环式的二级结构，当二级结构自由能达到一定值时，会阻碍核糖体小亚基在mRNA上的迁移扫描，对翻译起始具有阻止作用[17]；基因中5′UTR长度不同的转录本起始翻译的能力不同；另外5′UTR区域含有uAUG和uORF，该结构具有抑制翻译的作用，主要通过以下几种方式，如Ribosome扫描uORF合成短肽后过早的脱离mRNA、合成短肽后重新起始(re-initiation)ORF的翻译、合成的短肽可能在延长或终止阶段阻止翻译的进行、uORF介导mRNA的降解等；除此之外，一些基因的5′UTR区含有RNA G-quadruplex motif结构，这种特殊的二级结构也能抑制翻译[18]。3′UTR主要通过一系列调控元件来调控翻译，如成熟miRNA可通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译；3′UTR的一个显著poly A尾的长度与翻译效率密切相关，当<50 nt时，翻译抑制；>200 nt时，高效翻译；3′UTR区域含有多个AUUUA序列组成的ARE结构，ARE与多种蛋白结合，一类蛋白结合了ARE后维持mRNA的稳定性，促进翻译，另一类蛋白可以介导mRNA的降解或抑制翻译等。

基因的表达调控是一个复杂的过程，很多基因或蛋白在行使某些生物学功能时会受到不同程度的调控。目前，报告基因系统被广泛用于真核细胞表达调控的研究。利用报告基因系统研究表达调控可避免下游表达产物的干扰，能比较真实地反映调控序列的作用。本研究采用的pGL3-Control荧光素酶报告基因质粒特定的优点是其本身带有启动子序列能够自身启动转录表达，含有增强子序列可在多种哺乳动物中增强基因的表达，能研究某些特定片段在基因表达中的作用。

本研究成功构建了Tudor-SN的5′UTR、3′UTR荧光素酶报告基因质粒，为寻找Tudor-SN基因UTR区调控Tudor-SN蛋白的表达机制提供了依据。

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Construction of human Tudor-SN UTR luciferase reporter gene expression plasmid and its activity detection

ZHAOYali,SUChao,GANShihu,RENYuanyuan,GAOXingjie,YANGJie,HEJinyan

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To lay a foundation for further study on the mechanism of Tudor-SN protein in translation. Methods The human Tudor-SN UTR fragments were amplified by PCR from genomic DNA extracted from HeLa cells, and then were inserted into pGL3-Control expression vector. HeLa cells were co-transfected with the renilla luciferase plasmid and recombinant pGL3-5′UTR plasmid or pGL3-3′UTR plasmid. After 48 hours, luciferase activity was detected. Results Both double enzyme digestion and gene sequencing confirmed the construction of recombinant plasmid was successful. The luciferase activity was detected after transfection, and the luciferase activity of pGL3-5′UTR plasmid was the best. Conclusion The recombinant plasmids of pGL3-5′UTR-luciferase and pGL3-3′UTR-luciferase are successfully constructed, which lays a foundation for further study of regulatory mechanisms of Tudor-SN genetic UTR in translation.

human Tudor-SN protein; 5′UTR; 3′UTR; recombinant plasmid; luciferase

国家杰出青年基金资助项目(31125012)；教育部“创新团队发展计划”(IRT13085)；国家自然科学基金资助项目(31170830/31370749/31571380)；天津市应用基础与前沿技术研究计划(青年基金项目)(15JCQNJC09900)；天津医科大学青年基金项目(2015KYZQ03)。

赵亚丽(1990-)，女，硕士研究生，研究方向为细胞生物学。E-mail： zhaoyalismile@126.com

何津岩(1972-)，女，硕士生导师，副教授，研究方向为细胞分子通路。E-mail： hejinyan@tijmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.006

Q591.2,Q784

A

1002-266X(2017)04-0001-04

2016-09-01)