黄陆军，王冉冉，徐凌川

(山东中医药大学，济南 250355)

HPLC法测定土圞儿根皮和块根中的西瑞香素

黄陆军，王冉冉，徐凌川

(山东中医药大学，济南 250355)

建立高效液相色谱法测定土圞儿根皮和块根中西瑞香素含量的方法。采用Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇–0.2%磷酸水溶液(56∶44)为流动相等度洗脱，流量为1.0 mL／min，柱温为35℃，检测波长为345 nm。西瑞香素的质量浓度在20～100 μg／mL内与色谱峰面积呈现良好的线性关系，线性相关系数r=0.999 9，方法精密度(RSD)为1.23%(n=6)。根皮样品、块根样品的加标回收率分别为98.8%，98.2%，测定结果的相对标准偏差分别为1.30%，2%(n=6)。该方法快速可靠，可用于土圞儿药材的质量控制。

土圞儿；西瑞香素；高效液相色谱法

土圞儿为豆科植物土圞儿的干燥块根。土圞儿在《本草拾遗》中描述为“蔓如豆，根圆如卵”［1］，符合《中国植物志》和《山东植物志》记载土圞儿的形态特征［2］；《救荒本草》记载土圞儿别名为地栗子，属于浙江省民间用药［3］；土芋之“味甘”与土圞儿“味甜”表意一致［4–5］。《本草拾遗》中记载土芋可“解诸药毒，生研水服，当吐出恶物尽便止”；《贵州药植调查》：“治蛇咬伤，并治疗癀，去毒”［6］。《全国中草药汇编》［7］记载土圞儿可用于清热解毒，化痰止咳等功效。土圞儿含有的成分有丙酸、色氨酸、2-吡啶甲酸、scyllo-肌醇［8］等，其它有效成分的研究未见文献报道。

山东中医药大学实验室从土圞儿中分离得到一种化合物——西瑞香素，经文献查阅没有土圞儿中西瑞香素检测方法的报道。西瑞香素为香豆素类化合物，近年来对其药效学研究发现西瑞香素具有较强的血浆蛋白结合率［9］，西瑞香素体外对人肺腺癌细胞AGZY–83-a、人喉癌细胞Hep2和人肝癌细胞HepG2有明显抑制作用［10］以及抗炎抑菌作用［11］，还能明显降低心肌耗氧量［12］以及降低血压和血脂的作用［13］。为了进一步研究该西瑞香素成分及更好地对土圞儿进行质量评价，笔者采用高效液相色谱法对土圞儿根皮及块根中的西瑞香素进行了含量测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Prominence LC–20A 型，杭州赛析科技有限公司；

电子天平：FA1004型，上海精科天平厂；

超生液清洗器：KQ–500E型，昆山市超声仪器有限公司；

高速粉碎机：FW–100型，北京市永光医疗仪器厂；

西瑞香素对照品：上海圻明生物科技有限公司；

磷酸、甲醇：色谱纯，格里斯医药化学分析有限公司；

土圞儿样品：采自山东省菏泽市单县，经山东中医药大学徐凌川教授鉴定为豆科植物土圞儿。

1.2 西瑞香素标准溶液的配制

精密称定西瑞香素对照品5.00 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至标线，摇匀，配制成0.5 mg／mL西瑞香素标准样品溶液，置于冰箱4℃保存，待用。

1.3 供试品溶液的制备

分别精密称取土圞儿块根和根皮粉末20 g，置于圆底烧瓶中，加入95%的乙醇(为8倍药材的量)加热回流2次，第1次回流90 min，第2次回流60 min，合并两次药液，滤过，减压浓缩，所得浸膏用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，稀释至标线，摇匀，用0.45 µm滤膜过滤，即得。

1.4 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm)；柱温：35℃；流动相：甲醇–0.2%磷酸水溶液(体积比56∶44)，流量为1.0 mL／min；等度洗脱；进样体积：20 µL；检测波长：345 nm。

1.5 色谱图

在1.4色谱条件下，西瑞香素标准品与土圞儿供试品的保留时间分别为9.203，9.194 min，且土圞儿样品色谱图附近无其它杂质峰干扰，可以断定土圞儿中含有西瑞香素化学成分。西瑞香素对照品与土圞儿样品的色谱图分别见图1、图2。

图1 西瑞香素对照品色谱图

图2 土圞儿样品色谱图

2 结果与讨论

2.1 提取条件

以西瑞香素为含量指标，进行土圞儿提取条件的考察，加热回流两次，结果显示，第1次回流90 min，第2次回流60 min时提取效率最好，因此选择用95%乙醇回流提取两次。

2.2 检测波长

采用SPD检测器在210～400 nm波长范围内进行全波长扫描，采集光谱图。结果发现在345 nm时西瑞香素的色谱峰面积相对较高，峰形和分离度良好，基线平稳，因此实验选择345 nm作为检测波长。

2.3 流动相

为实现西瑞香素的良好分离，实验考察了等度洗脱，比较了甲醇–0.2%磷酸水溶液、乙腈–0.2%磷酸水溶液、乙腈–0.2%乙酸水溶液3种流动相体系，结果表明，以甲醇–0.2%磷酸水溶液(体积比为56∶44）［14］为流动相进行等度洗脱时样品的分离度高、基线平稳，各指标峰峰形良好，重复性良好。

2.4 色谱柱的选择

西瑞香素为香豆素类化合物，极性较大，因此对比了ZORBAX SB C18和Kromasil C18。结果表明，采用Kromasil C18色谱柱时，峰形和分离度较好，因此选用Kromasil C18色谱柱。

2.5 标准工作曲线

精密称取西瑞香素对照品5.00 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至标线，摇匀，得西瑞香素标准溶液。精密量取上述标准溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至标线，配制成质量浓度分别为10，20，40，80，100 µg／mL的西瑞香素系列标准工作溶液，用0.45 µm滤膜滤过，待用。分别吸取10 µL系列标准工作溶液，在1.4色谱条件下测定色谱峰面积，以西瑞香素质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程为Y=51 388X+1 185.4，r2=0.999 9。结果表明西瑞香素质量浓度在20～100 µg／mL内与色谱峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取100 µg／mL的西瑞香素对照品溶液10 µL，在1.4色谱条件下重复进样6次，色谱峰面积测定结果及相对标准偏差计算结果见表1。由表1可知，测定结果的相对标准偏差为1.23%，说明该方法的精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样，按照1.4色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，结果见表2。由表2可知，根皮中和块根中西瑞香素测定结果的相对标准偏差分别为1.7%，1.8%，说明样品在24 h内稳定性良好。

表2 稳定性试验结果

2.8 重复性试验

精密称取土圞儿根皮和块根样品各6份，按1.3方法制备后，在1.4色谱条件下进行测定，测定结果见表3。

表3 重复性试验结果

由表3可知，根皮中西瑞香素的含量为49.87 µg／g，块根中的含量是4.97µg／g，测定结果的相对偏差分别为1.8%，2%，说明方法的重复性满足检测要求。

2.9 加标回收试验

取已测定含量的土圞儿根皮和块根样品约20 g，共6份，精密称定。按照1.3方法制备后，分别加入适量的西瑞香素对照品溶液，在1.4色谱条件下进行测定，测定结果见表4。由表4可知，根皮和块根样品的加标回收率分别为98.8%和98.2%。

表4 加标回收试验结果

3 结语

采用95%乙醇加热回流提取工艺，建立了高效液相色谱法测定土圞儿中西瑞香素含量的分析方法。在选择的条件下方法的精密度、稳定性及重复性均能满足分析检测要求。该法简便、快捷，可用于土圞儿的质量控制。

［1］ 尚志钧.本草拾遗辑释［M］.合肥：安徽科学技术出版社，2003.

［2］ 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［M］.北京：人民卫生出版社，1994:47.

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Determination of Daphnoretin in Root Bark and Roof of Apios Fortunei Maxim by High Performance Liquid Chromatography

Huang Lujun, Wang Ranran, Xu Lingchuan
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355, China)

The method for determining daphnoretinin root bark and roof of apios fortunei maxim by high performance liquid chromatography was established. The separation was performed on Kromasil C18column (250 mm×4.6 mm，5µm) with methanol–0.2% phosphoric acid aqueous solution (55∶44) mobile phase, the fow rate was 1.0 mL／min. The column temperature was 35℃and the detection wavelength was 345 nm. The mass concentration of daphnoretinin was linear with chromatographic peak area in the range of 20–100 μg／mL, the correlation coeffcient was 0.999 9. The precision of the method (RSD) was 1.23%(n=6). The recovery of daphnoretinin root bark and roof were 98.8%, 98.2%, and the relative standard deviation were 1.3%, 2%(n=6), respectively. The method is accurate and rapid，and it can be used for the quality control of apios fortunei maxim.

apios fortunei maxim; daphnoretin; high performance liquid chromatography

O657.7

：A

：1008–6145(2017)01–0061–03

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.01.015

联系人：黄陆军；E-mail: 295684698@qq.com

2016–09–12