蒲江华，赵 峡，韩文伟，白明月

(中国海洋大学 海洋药物教育部重点实验室，山东省糖科学与糖工程重点实验室，医药学院，山东 青岛 266003)

亲水作用色谱在糖类化合物分析中的应用

蒲江华，赵 峡*，韩文伟，白明月

(中国海洋大学 海洋药物教育部重点实验室，山东省糖科学与糖工程重点实验室，医药学院，山东 青岛 266003)

糖类化合物的结构和组成分析对于探究糖的结构与功能的关系具有重要作用。亲水作用色谱(HILIC)对糖类等极性化合物具有良好的分离效果。该文介绍了适合糖类分析的常用HILIC柱固定相及其分离机制，论述了强洗脱溶剂比例、流动相pH值、缓冲盐浓度和色谱柱温度对HILIC分离效果的影响，并举例说明了HILIC法在单糖组成、糖胺聚糖二糖组成、寡糖聚合度、糖苷、糖脂、糖醇以及N-/O-糖链分析中的应用。

亲水作用色谱；固定相；保留机制；糖类分析；综述

糖及其复合物的分析检测在医学、药学、生物学等领域均具有重要作用。由于糖类化合物的极性较大，在反相色谱(RPLC)上保留太弱甚至不保留，常需经过衍生化带上疏水基团后才能进行分析；而在正相色谱(NPLC)上又保留过强，难以被非极性的流动相洗脱下来。亲水作用色谱(Hydrophilic interaction chromatography，HILIC)因以强极性材料作为固定相，以高比例的有机溶剂-水体系作流动相[1]，近年来广泛用于糖类、蛋白质、多肽、氨基酸、生物碱、皂苷等成分的分离和分析[2-4]。本文论述了适合糖类分析的常用HILIC柱固定相及其分离机制，探讨了强洗脱溶剂比例、流动相pH值、缓冲盐浓度、柱温等色谱条件对糖类化合物分离效果的影响，并列举了HILIC在不同糖类化合物分析中的应用。

1 常用固定相

HILIC色谱柱的固定相种类繁多，包括未衍生化的纯硅胶柱及一些极性官能团(如氨基、酰胺基、二醇基、氰基、糖基等)修饰的硅胶或者聚合物[5]，以适应不同的分离目的。以聚合物为基质的固定相能适用于强酸或强碱环境，但其分离效率远不如以硅胶为基质的固定相，因此应用较少[6]。在糖类化合物分析中常用的以硅胶为基质的固定相主要有氨基柱、酰胺基柱、两性离子柱、糖基柱等(图1)。氨基柱(如TSKgel NH2-100)是最早用于糖类化合物分析的HILIC柱，对糖的分离具有很好的选择性，但其受缓冲盐浓度和pH值影响较大，易与酸性化合物发生死吸附，且氨基易与还原糖的醛基形成席夫碱从而影响键合相的性质，因此在糖的分析中受到了限制[5,7-9]。酰胺基柱(如XAmide)稳定性好，不易发生死吸附，且选择性佳，在糖类化合物的分析中应用最为广泛[10]。两性离子柱(如ZIC-HILIC)的固定相表面同时含有正负电荷官能团，因此亲水性好，受pH值和离子作用的影响较小，对中性、碱性、酸性寡糖均具有很好的分离选择性[7,11]。糖基柱是在硅胶表面键合上糖基，如麦芽糖(Click maltose)、环糊精(Clickβ-CD)等，因此具有很强的极性和氢键作用，可广泛应用于单糖、寡糖、多糖和糖肽等分析[7,12]。

图1 在糖类化合物HILIC分析中常用的固定相结构Fig.1 Structure of stationary phase of HILIC column commonly used in carbohydrate analysis

2 保留机制

图2 亲水分配作用、氢键作用及静电作用机制示意图Fig.2 Mechanisms of hydrophilic partitioning,hydrogen bonding and electrostatic interaction

HILIC柱的保留机制较为复杂，主要有分配机制和吸附机制(包括氢键作用、偶极-偶极作用等)，还涉及静电作用和离子交换作用等[6,9,13-14]。分配机制是指分析物在亲水固定相吸附的水层与流动相之间发生液/液分配作用，是广为接受的HILIC保留机制[8]；氢键作用和静电作用常常发生在分析物与固定相材料之间，受流动相组成的影响较大，其作用模式如图2所示。糖是多羟基化合物，其在HILIC柱上的保留除分配作用外，还有较强的氢键作用，而且带电荷的酸性糖和碱性糖还会与固定相发生静电作用[9,15]。HILIC的保留机制主要取决于固定相特性、流动相组成以及分析物性质，随着分析条件改变，其保留机制也会相应改变[16-17]。

3 分离条件的影响

HILIC的分离效果受多种色谱条件的影响，其中强洗脱溶剂比例、流动相pH值、缓冲盐浓度及色谱柱温度对糖类化合物在HILIC柱上的保留均具有重要影响[11]。

3.1 强洗脱溶剂的影响

图3 水的比例对Click XIon柱分析低聚木糖聚合度的影响Fig.3 Influence of water proportion on degree of polymerization analysis of xylo-oligosaccharides by Click XIon column

HILIC的流动相一般是由水相-有机相组成的混合溶剂体系，水或者水的盐溶液为强洗脱溶剂，有机相为弱洗脱溶剂。理想的有机相应易与水混溶，且不能是质子供体或受体，所以一般多采用乙腈[18-19]。在HILIC模式中，化合物按照极性由小到大的顺序出峰，在乙腈和水组成的流动相中，强洗脱溶剂的增加会加快糖的出峰时间[9,20]。如本实验室考察了流动相对Click XIon柱分离低聚木糖聚合度的影响(图3)，发现随着水相比例的增加，低聚木糖的洗脱速度加快，分析效率提高，但同时分离度也有所降低。

3.2 流动相pH值的影响

流动相的pH值能影响极性分析物和固定相的电荷状态，从而影响分析物在HILIC柱上的保留强弱。若二者所带电荷相同则相斥，分析物在固定相上的保留会减弱；如带相反电荷则相吸，分析物的保留增强。pH值的影响与分析物性质和固定相种类相关，pH值对同一色谱柱不同性质的分析物以及同一分析物不同固定相的色谱柱均会有不同的影响[10,21-22]。Yan等[23]采用BEH Amide柱分离中性单糖时发现随着pH值的增加，糖的洗脱加快，保留时间缩短。这是因为pH值越高，糖脱质子化程度越高，与硅醇基发生静电相斥作用，所以中性单糖在色谱柱上的保留减弱。

Fu等[24]总结了流动相pH值对不同类型HILIC柱的影响，发现当pH值从6.8变化到3.0时，Clickβ-CD，Click Maltose，XAmide和Click TE-Cys这4种色谱柱的固定相表面会从负电荷转变为正电荷。所以，酸性糖应在pH≥6.8的条件下分离以减小离子作用；碱性糖应在pH≤3.0的条件下分离来减小静电吸引作用，避免峰拖尾。硅胶柱和二醇基柱在pH 6.8时表面带负电，而在pH 3.0时接近电中性，因此在pH 3.0的条件下既适宜分离碱性糖，又可用于分离酸性糖。TSK Amide-80柱在pH 3.0～6.8范围内带负电，在pH<7.0时适合分离酸性糖，在pH>7.0时适合分离碱性糖。

3.3 缓冲盐浓度的影响

3.4 色谱柱温度的影响

温度能影响流动相粘度、溶质扩散系数以及溶质在固定相和流动相之间的迁移焓变，对HILIC的分离效果有重要影响[10,17]。一般而言，柱温的升高能增大溶质的扩散系数，缩减保留时间，增加检测灵敏度[17]。如采用TSK Amide-80柱分离单糖时，随着柱温从40 ℃增加至60 ℃，各单糖的洗脱加快，糖的峰形变得更加尖锐[25]。但当以静电吸引为主导的保留机制时，温度的升高反而会导致保留的增强[12,18]。柱温除对HILIC柱的保留时间和灵敏度有影响以外，还能影响糖的峰形。如图4所示[24]，当柱温为30 ℃时，Click Maltose，XAmide，Silica，TSK Amide-80等HILIC柱会产生葡萄糖峰的α和β异构体裂分，且随着柱温上升，裂分程度逐渐降低甚至消失，具有这一特性的HILIC柱可以用于糖的异构体分析。Moni等[26]自制的糖基HILIC柱可在合适的低温条件下分离吡喃糖和呋喃糖的异构体。对于氨基柱、二醇基柱等，因它们自身的固定相材料能加快端基差向异构体的转换，可避免双峰的出现[7]。

4 实例分析

4.1 单糖组成及寡糖分析

单糖组成分析有利于多糖的结构解析，常采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色谱法[27]，该方法能同时分析11种常见的中性、酸性和碱性单糖，但衍生过程费时费力。而采用HILIC法分析单糖组成可不需衍生，前处理简单，分析时间短，如BEH amide柱可在30 min内完全分离8种植物来源的中性单糖[23]。HILIC法还能同时快速分析多种中性单糖、二糖和三糖，如Ikegami等[28]采用200T-PAAm硅胶柱，可在5 min内完成核糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、棉籽糖及景天庚酮糖的同时分离。但HILIC法方法的不足是尚不能同时完全分离多种中性、酸性和碱性单糖。

4.2 糖胺聚糖二糖组成分析

糖胺聚糖是一类酸性多糖，由糖醛酸和氨基糖组成的二糖片段重复连接而成。二糖组成中糖醛酸和氨基糖种类的不同以及硫酸化位点和个数的不同，使得糖胺聚糖结构多样化，从而具有不同的生理功效[29]。二糖组成一般采用强阴离子交换色谱法进行分析[30]，但该方法因使用高浓度的缓冲盐，难以与质谱联用进行在线检测。HILIC采用乙腈-水(或低浓度的挥发性缓冲盐)体系，可实现与质谱的在线联用，提高检测的灵敏度[12,31]。如采用ZIC-HILIC柱可同时分离2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记的不同位点取代及不同取代度的硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素[32]。

4.3 寡糖聚合度分析

寡糖的生物功能与其聚合度(dp)也有密切关系[33]，因此其聚合度分析方法的建立有助于产品的质量控制。寡糖聚合度分析常采用高效凝胶过滤色谱法，但对dp相近的同一系列寡糖分子量差异小，难以通过该方法达到基线分离，而HILIC法对不同dp的寡糖具有良好的分离效果。Fu等[34]采用麦芽糖基柱成功分离了dp10～50的果寡糖及dp5～25的壳寡糖。吴成玲等[35]研究发现酰胺基柱可以有效分离dp2～20的透明质酸寡糖；在较高温度下，两性离子柱可有效分离dp2～12的硫酸软骨素寡糖；而二醇基柱还可分离dp4～20的肝素寡糖。

图5 USP-HILIC柱分离多元醇类化合物[38]Fig.5 Analysis of a polyols mixture by USP-HILIC column[38]elution order:1,3,5-cis,cis-cyclohexanetriol,xylitol,mannitol,chiro-inositol and myo-inositol(洗脱顺序：1,3,5-环己烷三醇、木糖醇、甘露糖醇、D-手性肌醇、肌醇)

4.4 糖苷、糖脂及糖醇分析

HILIC在糖苷、糖脂和糖醇的分析检测方面也有重要应用。如金高娃等[36]采用Click XIon柱对皂苷、黄酮苷等14种糖苷类化合物实现了有效分离；Melo等[37]采用HILIC-ESI-MS法分离红藻Chondruscrispus中的糖脂并表征了其结构；Kotoni等[38]采用HILIC方法实现了1,3,5-环己烷三醇、木糖醇、甘露糖醇、肌醇及D-手性肌醇等多元醇的有效分离(图5)。

4.5 N-/O-糖链分析

糖链是细胞表面的重要生物信息分子，许多疾病与糖链结构的改变密切相关[39]。而糖链的结构解析一直是糖生物学的重难点，糖链的分离是糖链结构研究中至关重要的环节，对其结构解析的准确性有重要影响。HILIC可与质谱在线联用，用于N-/O-糖链的结构分析[40-41]。如可采用BEH amide柱分析仓鼠卵巢来源的融合蛋白及免疫球蛋白G4释放的N-糖链(图6)[42]；采用两性离子柱可分离唾液酸化的N-糖链的异构体[43]；采用TSKgel Amide-80可分析内源性鼠胃粘蛋白释放的O-糖链[44]等。

图6 BEH amide柱分析2-AB标记的融合蛋白(A)和免疫球蛋白G4(B)释放的N-糖链[42]Fig.6 2-AB-labeled N-glycans released from a CHO-derived fusion protein(A) and an NS0-derived IgG4(B) by BEH amide column[42]

5 结论与展望

HILIC对极性化合物和离子型化合物具有特殊的分离效果，弥补了RPLC和传统的NPLC在分析上的不足，为糖类化合物的分析开拓了新的局面。研究HILIC的保留机制及色谱条件(如流动相组成、pH值、缓冲盐浓度及柱温)对保留的影响，有助于实现糖类化合物更快和更好的分离效果。随着HILIC柱固定相材料的不断发展，可适应不同化合物的分离需求，在此，也期待能同时分离酸性、碱性和中性糖的色谱柱早日问世。此外，HILIC与质谱技术的联用也成为寡糖结构分析的重要手段，将可以进一步解决糖类分析中的更多难题。

[1] Alpert A J.J.Chromatogr.A,1990,499(2):177-196.

[2] Churms S C.J.Chromatogr.A,1996,720(1/2):75-91.

[3] Boersema P J,Mohammed S,Heck A J R.Anal.Bioanal.Chem.,2008,391(1):151-159.

[4] Guo Z M,Zhang X L,Xu Q,Liang X M.Chin.J.Chromatogr.(郭志谋,张秀莉,徐青,梁鑫淼.色谱),2009,27(5):675-681.

[5] Jandera P.J.Sep.Sci.,2008,31(9):1421-1437.

[6] Gama M R,Silva R G D C,Collins C H,Bottoli C B G.Trac-Trend.Anal.Chem.,2012,37(1/2):48-60.

[7] Shen A J,Guo Z M,Liang X M.Prog.Chem.(沈爱金,郭志谋,梁鑫淼.化学进展),2014,26(1):10-18.

[8] Ikegami T,Tomomatsu K,Takubo H,Horie K,Tanaka N.J.Chromatogr.A,2008,1184:474-503.

[9] Hemström P,Irgum K.J.Sep.Sci.,2006,29(12):1784-1821.

[10] Guo Y,Gaiki S.J.Chromatogr.A,2011,1218(35):5920-5938.

[11] Qiao L,Shi X,Xu G.TRAC-Trend.Anal.Chem.,2016,81:23-33.

[12] Jandera P.Anal.Chim.Acta,2011,692:1-25.

[14] Buszewski B,Noga S.Anal.Bioanal.Chem.,2012,402:231-247.

[16] Guo Y.Analyst,2015,140(19):6452-6466.

[17] Hao Z,Xiao B,Weng N.J.Sep.Sci.,2008,31(9):1449-1464.

[18] Greco G,Letzel T.J.Chromatogr.Sci.,2013,51(7):684-693.

[19] Li R P,Yuan Q,Huang Y P.Chin.J.Chromatogr.(李瑞萍,袁琴,黄应平.色谱),2014,32(7):675-681.

[20] Jiang G,Shen A J,Guo Z M,Li X L,Liang X M.Chin.J.Chromatogr.(姜舸,沈爱金,郭志谋,李秀玲,梁鑫淼.色谱),2015,33(9):929-933.

[21] Chirita R I,West C,Finaru A L,Elfakir C.J.Chromatogr.A,2010,1217(18):3091-3104.

[22] Fountain K J,Xu J,Diehl D M,Morrison D.J.Sep.Sci.,2010,33(6/7):740-751.

[23] Yan J,Shi S,Wang H,Liu R M,Li N,Chen Y L,Wang S C.Carbohydr.Polym.,2016,136:1273-1280.

[24] Fu Q,Tu L,Li Z,Xu X Y,Ke Y X,Jin Y,Liang X M.Carbohydr.Res.,2013,379C(18):13-17.

[25] Karlsson G,Winge S,Sandberg H.J.Chromatogr.A,2005,1092(2):246-249.

[26] Moni L,Ciogli A,D’Acquarica I,Dondoni A,Gasparrini F,Marra A.Chem.Eur.J.,2010,16(19):5712-5722.

[27] Zhang L Y,Zhao X,Chen H H.J.Instrum.Anal.(张璐瑶,赵峡,陈欢欢.分析测试学报),2016,35(3):367-372.[28] Ikegami T,Horie K,Saad N,Hosoya K,Fiehn O,Tanaka N.Anal.Bioanal.Chem.,2008,391(7):2533-2542.

[30] Keire D A,Trehy M L,Reepmeyer J C,Kolinski R E,Ye W,Dunn J,Westenberger B J,Buhse L F.J.Pharm.Biomed.,2010,51(4):921-926.[31] Nguyen H P,Schug K A.J.Sep.Sci.,2008,31(9):1465-1480.

[32] Hoshi H,Shimawaki K,Takegawa Y,Ohyanagi T,Amano M,Hinou H,Nishimura S I.Biochim.Biophys.Acta,2012,1820(9):1391-1398.

[33] Zou P,Yang X,Wang J,Li Y F,Yu H L,Zhang Y X,Liu G Y.FoodChem.,2016,190:1174-1181.

[34] Fu Q,Liang T,Zhang X L,Du Y G,Guo Z M,Liang X M.Carbohyd.Res.,2010,345(18):2690-2697.

[35] Wu C L,Liu J F,Zhang Z Q.Chin.J.Anal.Chem.(吴成玲,刘建芬,张真庆.分析化学),2015,43(8):1198-1202.[36] Jin G W,Ding J J,Chen X,Yan J Y,Guo Z M,Zhang X L,Liang X M.J.Instrum.Anal.(金高娃,丁俊杰,陈雪,闫竞宇,郭志谋,张秀莉,梁鑫淼.分析测试学报),2014,33(2):133-137.

[37] Melo T,Alves E,Azevedo V,Martins A S,Neves B,Domingues P,Calado R,Abreu M H,Domingues M R.AlgalRes.,2015,8(Re 1):181-191.

[38] Kotoni D,D'Acquarica I,Ciogli A,Villani C,Capitani D,Gasparrini F.J.Chromatogr.A,2012,1232:196-211.[39] Lange T,Samatov T R,Tonevitsky A G,Schumacher U.Carbohydr.Res.,2014,389(1):39-45.

[40] Wuhrer M,Boer A R D,Deelder A M.MassSpectrom.Rev.,2009,28(28):192-206.

[41] Ongay S,Boichenko A,Govorukhina N,Bischoff R.J.Sep.Sci.,2012,35(18):2341-2372.

[42] Shang T Q,Saati A,Toler K N,Mo J,Li H,Matlosz T,Lin X,Schenk J,Ng C K,Duffy T,Porter T J,Rouse J C.J.Pharm.Sci.,2014,103(7):1967-1978.

[43] Takegawa Y,Deguchi K,Ito H,Keira T,Nakagawa H,Nishimura S I.J.Sep.Sci.,2006,29(16):2533-2540.

[44] Goso Y.Anal.Biochem.,2016,496:35-42.

Application of Hydrophilic Interaction Chromatography in Analysis of Carbohydrates

PU Jiang-hua,ZHAO Xia*,HAN Wen-wei,BAI Ming-yue

(Key Laboratory of Glycoscience and Glycotechnology of Shandong Province,Key Laboratory of Marine Drugs of Education Ministry,School of Medicine and Pharmacy,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The analysis of carbohydrate structure and composition plays a vital role in the study of structure-activity relationship of carbohydrates.Hydrophilic interaction chromatography(HILIC) could be used to separate polar compounds like carbohydrates with satisfactory resolution.The stationary phase and retention mechanism of HILIC column commonly used in carbohydrates analysis were introduced.The effects of strong elution solvent ratio,mobile phase pH value,buffer salt concentration and column temperature on separation were also discussed.Application examples in analysis of monosaccharide composition,disaccharide composition of glycosaminoglycans,polymerization degree of oligosaccharides,glycosides,glycolipids,sugar alcohols and N-/O-glycans by HILIC were illustrated in this paper.

hydrophilic interaction chromatography;stationary phase;retention mechanism;carbohydrate analysis；review

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.025

2016-07-17；

2016-09-20

国家自然科学基金-山东省政府联合资助项目(U1406402)；国家“十二五”科技支撑计划(2013BAB01B02)

*通讯作者：赵 峡，博士，教授，研究方向：海洋糖类药物，Tel：0532-82031560，E-mail：zhaoxia@ouc.edu.cn

O657.7；O629.1

A

1004-4957(2017)01-0145-06