龚 倩,郗存显,聂福平,曹淑瑞,唐柏彬,王国民,陈冬东,母昭德*

(1.重庆医科大学 药学院，重庆 400016；2.重庆出入境检验检疫局 重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆 400020；3.重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 400016；4.中国检验检疫科学研究院，北京 100123)

猪肉中β-受体激动剂AlphaLISA检测方法的建立

龚 倩1,3,郗存显2,聂福平2,曹淑瑞2,唐柏彬2,王国民2,陈冬东4,母昭德1,3*

(1.重庆医科大学 药学院，重庆 400016；2.重庆出入境检验检疫局 重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆 400020；3.重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 400016；4.中国检验检疫科学研究院，北京 100123)

建立了快速检测猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林4种β-受体激动剂的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫(AlphaLISA)分析方法。样品经乙酸铵和β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶酶解提取过柱，浓缩至干后，用缓冲溶液定容。样品与生物素化抗原、抗体、供体微珠和受体微珠进行酶联免疫，AlphaLISA进行检测，基质标准曲线定量。结果表明：沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗和特布他林在0.1～500 ng/mL范围内呈良好线性，相关系数均大于0.98，沙丁胺醇与克伦特罗、溴布特罗和特布他林的交叉反应率分别为 143.3%，179.2%和95.6%，检出限为0.03～0.08 ng/mL。在0.5，10，20 μg/kg 3个添加水平下，4种化合物的平均回收率为82.5%～115.9%，相对标准偏差(RSD)均小于 12.0%。该方法操作简单，快速准确，适用于猪肉中β-受体激动剂的筛选与检测。

AlphaLISA；β-受体激动剂；猪肉

β-受体激动剂(如克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特罗、特布他林等)属于苯乙胺类药物[1]。在临床上，β-受体激动剂可以放松支气管平滑肌，增加纤毛运动频率，调节粘膜纤毛的清除率，可以用于治疗支气管炎和哮喘等疾病[2-3]。在养殖业中，β-受体激动剂可以增加脂类分解和脂肪细胞中脂类生成，增加肝糖分解和蛋白质的合成，减少横纹肌纤维蛋白质的水解作用，故常用作促生长剂,以促进饲料转化率，增加瘦肉率[4-5]。β-受体激动剂易在动物脏器中积聚残留，并通过食物链进入人体，摄入过量会导致心悸、头疼、恶心，甚至损害肝肾[6-7]。所以对克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林等β-受体激动剂的监测非常必要。

图1 研究采用的反向竞争 AlphaLISA反应模式Fig.1 Reverse competition AlphaLISA in this article

β-受体激动剂的监测方法已有很多文献报道，主要有酶联免疫法(ELISA)[8]、超高效液相色谱法(UPLC)[9-10]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[11]和气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[3]等。由于色谱法操作繁琐，不适于现场快速检测[12]。酶联免疫法则存在假阳性、免疫过程时间长和酶标物易失活等问题。而纳米均相时间分辨荧光免疫技术(AlphaLISA)法是一个均相的免疫方法，具有快速、 稳定、灵敏、免洗、无放射污染以及操作简单等特点。该技术主要依赖于供体微珠和受体微珠之间的相互作用。当抗原抗体发生反应使供体微珠和受体微珠相互接近发生级联反应，产生极大放大的信号，并被仪器检测记录。即当两种微珠在680 nm的激光照射下，供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧将能量传递给受体微珠激发615 nm的光(图1)。当待测物与生物素化抗原竞争抗体时，供体微珠和受体微珠将无法相互靠近，从而使得单体氧无法扩散到受体微珠，导致光信号下降[13-15]。现有的AlphaLISA法主要用于血液[16]、蛋白质[17]、病原体[18]、癌症[19]、新药研究等领域，而在食品安全检测方面鲜有应用。本研究将沙丁胺醇抗原进行生物素化后，首次应用AlphaLISA反向竞争模式对肉类中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林4种β-受体激动剂进行检测。该方法快速、简单、灵敏度高，适用于大量样品的筛选和检测，为肉类中β-受体激动剂的实际检验提供了重要的参考价值。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特罗、特布他林、西马特罗、齐帕特罗、喷布特罗、苯乙醇胺A、妥布特罗(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)；偶联有BSA的沙丁胺醇抗原和单克隆抗体由北京中检维康有限公司提供；生物素(B-1001-105，美国Solulink公司)；正己烷、乙酸铵(色谱纯，Tedia公司)；β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶(≥100 000 U/mL，Sigma公司)；受体微珠，供体微珠，10×buffer缓冲液以及384孔板(美国PerkinElmer公司)；MCX 柱(3 mL/60 mg，美国Waters Corporation公司)；其他化学品和试剂均为分析纯，购于Sigma公司或Dr.Ehrenstorfer GmbH。

多标记微孔板检测仪(AlphaLISA仪，EnSpire 2300，美国PerkinElmer公司)；BS224S天平(德国Sartorius公司)；N-EVAP 116氮吹仪(美国Organomation公司)，SR-2DS强力振荡器(日本Taltec公司)，涡旋振荡器(江苏康健医疗用品有限公司)，3-30K离心机(德国Sigma公司)，IPP500烘箱(美墨尔特公司)，超纯水仪(Milford,MA,USA)。

1.2 溶液配制

1.2.1 微珠溶液的制备根据说明，将10×buffer用超纯水稀释为1×buffer溶液。用1×buffer溶液将供体微珠稀释至0.15 mg/mL，受体微珠稀释至0.18 mg/mL。

1.2.2 生物素化抗原的制备生物素化抗原通过生物素化方法得到：取偶联有BSA的沙丁胺醇抗原32 μL，加至250 μL EP管中，再加入2 μL生物素，混匀离心1 min。室温下避光放置90 min，4 ℃储存。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取折算成目标化合物为10 mg(精确至0.000 01 g)的各标准品，溶解在10 mL甲醇溶液中制成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液并储存在-20 ℃。将上述标准储备溶液逐级稀释成1 mg/L的标准溶液，储存在4 ℃供日常使用。

1.4 样品制备

猪肉、牛肉组织样品购于超市。准确称取5 g样品，置于50 mL离心管中，并加入20 mL乙酸铵溶液(2 mol/L,pH 5.2)、50 μLβ-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶以及标准品溶液，涡旋混匀后37 ℃下振荡提取16 h。7 000 r/min离心5 min，上清液转移至新的50 mL离心管中。向离心管中加入20 mL 正己烷，振荡20 min。7 000 r/min离心5 min，弃去正己烷层，水相立即经滤纸过滤，并用2 mL乙酸铵溶液洗涤滤纸。待净化。

取MCX柱用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL盐酸(0.1 mol/mL)进行活化，将样品提取液转入MCX柱中，用3 mL水、3 mL甲醇-水溶液(1∶1)和3 mL正己烷淋洗，弃去洗脱液，吹干。再用3 mL洗脱液(50 mL乙酸乙酯，45 mL甲醇，5 mL氨水)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在40 ℃下氮气吹干。残留物用1 mL 1×buffer溶解，涡旋混匀2 min，过0.22 μm微孔滤膜。供检测。

1.5 检测方法

在已优化条件下，取白色不透明微孔板,每孔加入5 μL生物素化沙丁胺醇抗原(1∶3 200),5 μL沙丁胺醇抗体，5 μL标准品或者样品，离心1 min，37 ℃避光孵育30 min后，依次加入 5 μL供体微珠(0.15 mg/mL)和5 μL受体微珠(0.18 mg/mL)，离心1 min充分混匀,37 ℃避光孵育60 min。用 AlphaLISA检测仪测定每个待测孔的光信号强度，绘制标准曲线,根据标准曲线计算样品中待测物的含量。

图2 生物素化抗原和抗体浓度的优化Fig.2 Concentration optimization of biotinylated antigen and antibody

图3 供体微珠浓度的优化Fig.3 Concentration optimization of donor beads

2 结果与讨论

2.1 抗原-抗体浓度的优化

用1×buffer缓冲溶液将生物素化抗原稀释至：1∶100，1∶200，1∶400,1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800。抗体做相同系列稀释倍数，采用棋盘法进行条件优化。每个浓度加至孔板中，其中最后1个孔只加Buffer作空白对照。按照“ 1.5”步骤进行检测，将待测样品替换成buffer。各浓度的信号强度值如图2所示，生物素化抗原浓度在1∶3 200～1∶6 400倍稀释，抗体在1∶1 600～1∶6 400倍稀释时，信号强度值较高。当抗原和抗体稀释倍数均为1∶3 200时，荧光值达到最高。在此浓度范围内，综合考虑荧光强度、抗原抗体成本及用量等，选择生物素化抗原浓度1∶3 200，抗体浓度1∶3 200作为最适实验条件。

2.2 供体微珠和受体微珠浓度的优化

供体微珠和受体微珠用1×buffer缓冲溶液分别稀释至0.03,0.06，0.09，0.12，0.15，0.18，0.21 mg/mL。按“ 1.5 ”步骤进行条件优化(图3)。结果表明，随着供体微珠浓度的增加，相应的荧光值也增加，当浓度为0.15 mg/mL时，荧光值达到最大。受体微珠浓度与荧光值的变化规律与供体微珠类似，当受体微珠浓度为0.18 mg/mL时，荧光值达到最大。故本实验选择供体微珠的最佳浓度为0.15 mg/mL，受体微珠的最佳浓度为0.18 mg/mL。

2.3 基质效应

采用基质溶液和溶剂分别配制相同浓度的标液，对克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林进行基质效应评价。基质效应强弱的计算方法为：

当ME%<0 时表示存在抑制效应，ME%>0 时表示存在增强效应。绝对值为20%～50%时存在中等基质效应，绝对值>50%时存在较强的基质效应。计算结果显示，4种化合物的ME%值为12%～67%，表明基质效应较强。为满足检测要求，本实验采用配制基质标准曲线来消除基质影响。

2.4 标准曲线与灵敏度

取1 mg/mL的标准储备溶液配制成系列标准工作溶液(浓度为0.1，1，5，10，20，50，100，500 ng/mL)，优化条件下测定。结果显示，该方法对沙丁胺醇、溴布特罗、克伦特罗及特布他林的检出限 LOD(IC10)分别为0.06，0.03，0.05，0.08 ng/mL，在范围为0.1～500 ng/mL进行线性拟合，获得良好的线性关系，其线性方程分别为y=-0.242 3x+0.682 0，y=-0.194 5x+0.748 5，y=-0.212 4x+0.699 8，y=-0.158 9x+0.671 6，相关系数均大于0.98。

表1 沙丁胺醇和其他化合物的交叉率

2.5 特异性

将结构或功能相似的10种化合物(盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特罗、特布他林、西马特罗、齐帕特罗、喷布特罗、苯乙醇胺A和妥布特罗)用1×buffer缓冲溶液分别配成浓度为0.1～500 ng/mL的待测溶液。用已建立的AlphaLISA 方法进行检测，测定 IC50值(表1)。沙丁胺醇与盐酸克伦特罗、溴布特罗的交叉反应率>100%，与特布他林的交叉反应率为95.6%，与其余6种化合物无交叉反应。表明该方法可用于沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗和特布他林的筛选和检测。

2.6 样品的测定

对市售的猪肉样品进行提取，采用已建立的AlphaLISA 方法进行检测，结果表明，猪肉样品中均未检出沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗及特布他林。进一步对猪肉样品进行加标回收试验，加标水平分别为0.5，10，20 μg/kg，每个浓度水平重复检测 3 次，结果见表2。沙丁胺醇、溴布特罗、克伦特罗及特布他林的回收率为82.5%～115.9%，相对标准偏差均小于 12.0%。将已建立的AlphaLISA法与液相色谱-串联质谱法进行比较(见表2)。结果显示，AlphaLISA法的回收率与精密度良好，达到检测要求，可用于猪肉中沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗及特布他林4种β-受体激动剂的筛选和检测。

表2 猪肉样品的回收率

3 结 论

本文建立了一种准确、快速检测沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗和特布他林4种β-受体激动剂的分析方法，该方法灵敏度高，检测时间短，适用于大量样品的筛选和检测，可成功用于猪肉中上述4种β-受体激动剂的筛选和检测，从而为肉类产品的安全性和可靠性提供了技术保障。

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Quantitative Determination of β-Agonists in Pork Using the Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay

GONG Qian1,3,XI Cun-xian2,NIE Fu-ping2,CAO Shu-rui2,TANG Bo-bin2,WANG Guo-min2,CHEN Dong-dong4,MU Zhao-de1,3*

(1.College of Pharmacy,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Chongqing Engineering Technology Research Center of Import and Export Food Safety,Chongqing 400020,China;3.Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology,Chongqing 400016, China;4.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100123,China)

An amplified luminescent proximity homogeneous assay(AlphaLISA) was developed for the determination of four kinds ofβ-agonists(clenbuterol,salbutamol,brombuterol,terbutaline) in pork.The analytes were stepwise extracted with ammonium acetate andβ-glucuronidase/sulfatase,the extract was columned and concentrated to dryness,redisolved in buffer.Samples were reacted with botinylated antigen,antibody,donor beads and acceptor beads,and detected by AlphaLISA with matrix standard curve.As a result,there are good linear relationships in the concentration range of 0.1-500 ng/mL，with correlation coefficients larger than 0.98.The cross-reactivities for clenbuterol,brombuterol,terbutaline were 143.3%,179.2%and 95.6%,respectively,and the limits of detection(LOD) were 0.03-0.08 ng/mL.The average recoveries of four compounds at spiked levels of 0.5,10,20 μg/kg were in the range of 82.5%-115.9%with relative standard deviations(RSD) not less than 12.0%.The method is simple,rapid and accurate,and is suitable for the detection and screening ofβ-agonists in pork.

AlphaLISA;β-agonists;pork

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.020

2016-08-13；

2016-09-20

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2015IK333)；质检公益性行业科研专项项目(201210086)

*通讯作者：母昭德，教授，研究方向：药物分析，Tel：18108396565，E-mail：1281618155@qq.com

O657.3；TQ460.72

A

1004-4957(2017)01-0117-05