孙志杰，吕名秀，卢 奎，段冰潮，刘广斌

(1.郑州大学 化学与分子工程学院，河南 郑州 450001；2.河南工程学院 材料与化学工程学院，河南 郑州 450007)

酪氨酸四肽与ct-DNA的相互作用

孙志杰1,2，吕名秀1,2，卢 奎2*，段冰潮1，刘广斌1

(1.郑州大学 化学与分子工程学院，河南 郑州 450001；2.河南工程学院 材料与化学工程学院，河南 郑州 450007)

采用Fmoc固相合成法合成了酪氨酸四肽(YYYY)，经液相色谱-高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，并用电喷雾质谱(ESI-MS)表征后，得到纯度大于90%的四肽，利用紫外光谱、圆二色光谱和荧光光谱研究了肽YYYY与ct-DNA的相互作用。结果表明，随着肽浓度的增加，ct-DNA的紫外吸收产生明显的增色效应，荧光猝灭显著，圆二色光谱发生红移。研究推测酪氨酸四肽以沟槽方式与ct-DNA发生相互作用，且酪氨酸四肽与ct-DNA的作用强于酪氨酸。

酪氨酸四肽；ct-DNA；相互作用；Fmoc固相合成法

白癫疯是一种常见的后天性表皮色素脱失性皮肤病，主要与人体酪氨酸酶的缺失有关。白癜风患者食用含有酪氨酸的食物可以促进黑色素的形成，减轻白癜风症状。酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料[1]。小肽是生命体内的基本配体，是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，可以调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢的通透性，或是通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应，发挥其药理作用[2-3]。与氨基酸相比，寡肽的吸收速度和效率更高，且其可由肠道不经降解直接吸收[4]。由此可以推测，酪氨酸寡肽比酪氨酸具有更高的生物活性。为了考察酪氨酸寡肽的性质及其在生物医药领域的应用价值，本文研究了酪氨酸及酪氨酸四肽与ct-DNA的相互作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo Scientific LCQ Fleet离子阱质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Agilent1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；MOS-500圆二色谱仪(法国Bio-logic公司)；UV-3600紫外可见近红外分光光度计(日本Shimadzu公司)；Cary Eclipse荧光分光光度计(澳大利亚Agilent公司)；Thermo ScientificLGJ-10冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)；SZ-93自动双重纯水蒸馏仪(上海亚荣生化仪器厂)；PHS-3C型精密PH计(上海精密科学仪器有限公司)；多肽固相合成管(郑州利研科技有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵和HJ-1磁力搅拌仪(巩义市英峪予华仪器厂)。

小牛胸腺DNA(ct-DNA，Sigma 公司),直接溶于pH 7.0 的0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲溶液中，纯度以260 nm与280 nm处吸光度的比值检测确定(A260/A280=1.89>1.80，符合实验要求)；溴化乙锭(EB，Sigma公司)；酪氨酸四肽(实验室合成)，通过液相色谱测定其纯度为94.50%;Fmoc-Tyr-(tBu)-Wang Resin(0.39 mmol/g)、Fmoc-Tyr-(tBu)-OH、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、酪氨酸均购于上海吉尔生化有限公司；哌啶(国药化学试剂有限公司)；二甲基甲酰胺(DMF)、茚三酮、乙腈(色谱纯)、苯酚、二氯甲烷、乙醚(天津市科密欧化学试剂有限公司)；三氟乙酸(TFA)、苯甲硫醚、乙二硫醇(阿拉丁试剂上海有限公司)；其它试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 Tyr-Tyr-Tyr-Tyr的合成称量Fmoc-Tyr-(tBu)-Wang Resin 1.50 g于干燥的固相合成管中，加入10 mL DMF，用氮气搅拌溶胀30 min后减压抽滤，再加入 10 mL 20%的哌啶DMF溶液，30 min后脱洗，用茚三酮溶液检测，若颜色变为深紫色或黑色则脱保护完成，否则重复上述过程直至脱除完全。合成管中加入偶联液，避光氮气保护下反应4 h，脱洗，检测树脂不变色则偶联完全，否则二次投料重复偶联。重复以上步骤直至酪氨酸四肽合成，切割洗涤，置于通风橱中晾干，得到粗产品[5-6]。

1.2.2 高效液相色谱分离纯化将固相合成得到的粗产品用水或甲醇溶解，进行液相色谱分离。液相色谱条件:Agilent ZORBAX300SB-C18色谱柱(9.40 mm×250 mm，5 μm);柱温为室温;进样量200 μL;流动相为70%A+30%B(A 液为0.10%三氟乙酸溶液，B液为含0.10%三氟乙酸的乙腈溶液);流速1.00 mL/min;检测波长220 nm。

1.2.3 紫外-可见吸收光谱测定在比色皿中加入3 mL ct-DNA溶液(cct-DNA=5.0×10-5mol/L),向其中滴加一系列的肽，振荡静止15 min，其加入量以一系列Rt(Rt1=cTyr/cct-DNA;Rt2=cTyr-Tyr-Tyr-Tyr/cct-DNA)值决定，进行紫外光谱扫描。

1.2.4 荧光光谱测定肽浓度对ct-DNA的影响：于一系列10 mL比色管中加入DNA-EB溶液(cct-DNA=5.0×10-5mol/L，cEB=5.0×10-6mol/L),再加入一定量的Tyr和Tyr-Tyr-Tyr-Tyr溶液，其加入量以一系列Rt(Rt1=cTyr/cct-DNA;Rt2=cTyr-Tyr-Tyr-Tyr/cct-DNA)值决定，用Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.0)稀释至刻度，摇匀，37 ℃下放置1 h，测定其荧光发射光谱(λex=260 nm，狭缝(宽度)Ex=Em=5 nm)。

ct-DNA的热变性温度的测定：DNA的变性温度Tm是指DNA在加热过程中双螺旋结构失去一半时的温度。配制一系列DNA-EB(cct-DNA=5.0×10-5mol/L，cEB=5.0×10-6mol/L)溶液，再分别加入适量浓度的肽溶液，取3 mL至比色皿中，从25 ℃升温至100 ℃，每隔5 ℃进行荧光发射光谱扫描,以F25 ℃/Ft对温度T作图。

1.2.5 圆二色光谱测定配制DNA-Tris溶液(cct-DNA=5.0×10-5mol/L)，取3 mL至比色皿中，向其中滴加一系列的肽，振荡静止15 min，测定其圆二色光谱信号。

2 结果与讨论

2.1 Tyr-Tyr-Tyr-Tyr的液相色谱纯化及质谱检测

对纯化后的Tyr-Tyr-Tyr-Tyr进行RP-HPLC检测，并经面积归一法计算得到其纯度为94.50%。对其进行质谱图扫描，在m/z=671.17观察到酪氨酸四肽的分子离子峰，表明产品的纯度较高。收集纯化目标产物，经冷冻干燥得白色粉末状酪氨酸四肽。

2.2 紫外光谱

小分子与ct-DNA发生相互作用后，可根据ct-DNA吸收峰强度的变化以及特征吸收峰的位移来判断小分子与ct-DNA发生的相互作用。ct-DNA中含有芳香性碱基和磷酸生色团，其电子吸收光谱在260 nm左右有强的吸收峰。当小分子与ct-DNA相互作用的吸收光谱同时出现减色和红移现象时，说明ct-DNA分子的轴向发生变化，即构象改变，可认为小分子与ct-DNA相互作用的模式为嵌插模式[7]。从图1可以看出，随着肽浓度的增加，ct-DNA在260 nm处的最大吸收峰均出现了增色效应，并且伴有微弱的红移。表明肽与ct-DNA相互作用的模式不是经典的嵌插模式，可能是静电或沟槽结合方式。ct-DNA的碱基是紫外光谱的生色团，在正常情况下，ct-DNA的碱基被包裹在ct-DNA磷酸骨架内部，由于肽链含有酪氨酸，侧链携带有胺基，可以伸入DNA螺旋内部作用于DNA的碱基，同时由于DNA碱基疏水区域与肽链骨架的疏水作用力，导致DNA碱基对之间的氢键作用力受到影响，使DNA的碱基对更多的暴露出来，致使整个DNA的紫外吸收增加[8]。图中表明Tyr-Tyr-Tyr-Tyr(YYYY)对ct-DNA的增色效应明显增加，这可能是由于酪氨酸四肽结构中还有较多的酪氨酸残基等芳香基团，使其与ct-DNA的沟槽作用比酪氨酸更强。

2.3 荧光光谱

溴化乙锭(EB)作为一个具有共轭芳香平面型结构的分子，本身荧光很弱，嵌入到双螺旋内部的碱基对后可使ct-DNA 荧光显著增强[9]。当EB 从双螺旋中出来或双螺旋减少时，荧光强度会显著降低，因而EB 可作为ct-DNA 结构的荧光探针。如果体系中存在其它能与ct-DNA 发生作用的小分子时，该分子会与EB 竞争与ct-DNA 结合，并将EB 从双螺旋中挤出，从而减弱与EB-DNA 体系的荧光强度，而体系的荧光强度减弱程度与小分子和ct-DNA 结合作用的强度存在对应关系[10]。因此，可借助小分子对EB-DNA体系荧光强度的影响，研究其与ct-DNA 作用的情况。

2.3.1 肽浓度对ct-DNA的影响测定了不同浓度的酪氨酸和酪氨酸四肽分别与DNA-EB体系在600 nm处的荧光强度(图2)。由图2可知，随着EB-DNA 体系中Tyr 及Tyr-Tyr-Tyr-Tyr 浓度的增加，体系在600 nm处的荧光强度逐渐减弱，表明二者均对EB-DNA 体系有荧光猝灭作用，且Tyr-Tyr-Tyr-Tyr的猝灭作用更强。

2.3.2 荧光猝灭方式的判断及结合常数的计算荧光猝灭过程可分为动态猝灭和静态猝灭。静态猝灭是基态配合物的生成往往引起荧光物质吸收光谱的改变，是由于猝灭剂与荧光物质在基态时生成不发荧光的配合物所致。动态猝灭是荧光物质分子处于激发态时与猝灭剂分子相互碰撞，导致荧光发生猝灭，该方式只影响荧光分子的激发态，并不改变荧光物质的吸收光谱[11-12]。如果Tyr-Tyr-Tyr-Tyr对DNA-EB体系为动态猝灭过程，其作用过程遵循Stern-Volmer方程[13]：F0/F=1+Kqτ0[Q]。式中，F0和F分别表示不存在和存在猝灭剂时体系的荧光强度;Kq为猝灭常数;τ0为不存在猝灭体时荧光分子的平均寿命(生物大分子的荧光寿命约为10-8s);[Q]为体系猝灭剂的浓度。根据公式计算得出Tyr-Tyr-Tyr-Tyr对EB-DNA 的猝灭常数Kq=5.89×1012，大于Tyr 的猝灭常数，且两者均大于小分子化合物与生物大分子之间最大扩散控制的碰撞常数2.00×1010L·mol-1·s-1，证明两者对ct-DNA体系的猝灭作用不是扩散和碰撞所引起的动态猝灭，而是Tyr和Tyr-Tyr-Tyr-Tyr “镶嵌”在ct-DNA 双螺旋结构中，形成了某种特定结构的化合物所引起的静态猝灭[14]。

表1 酪氨酸四肽、酪氨酸与DNA-EB体系在不同温度下的荧光猝灭常数

静态猝灭过程遵循下式方程：F0/F=1+Ksv[Q]，式中，Ksv为静态猝灭常数。 以F0/F对[Q]作一元线性拟合，可得到肽Tyr-Tyr-Tyr-Tyr在T=310，300，290 K时的Ksv值。由图3和表1可看出，随着温度的升高，肽的Ksv值逐渐减小，这符合静态猝灭的特征[15]，且两者的Kq值均大于小分子化合物与生物大分子之间最大扩散控制的碰撞常数(2.00×1010L·mol-1·s-1)，这说明肽对DNA-EB复合物体系的猝灭作用是静态猝灭。由表知Tyr-Tyr-Tyr-Tyr 的Ksv大于Tyr 的Ksv，说明酪氨酸四肽比酪氨酸能更好地与ct-DNA 发生相互作用。

图4 酪氨酸四肽、酪氨酸与DNA-EB体系的热变性曲线Fig.4 The melting curve of DNA-EB in the presence of YYYY and Y cct-DNA=5.0×10-5 mol/L,cEB=5.0×10-6 mol/L,cYYYY=cY=5.0×10-5 mol/L

2.3.3 ct-DNA的热变性通过测定ct-DNA的热变性温度(Tm)可以区分小分子与ct-DNA的作用模式[16]。由图4可知，ct-DNA-EB复合物体系的热变性温度为95 ℃，随着肽的加入，ct-DNA-EB-肽体系的热变性温度相比于ct-DNA-EB体系均下降。说明肽的加入使得EB对ct-DNA的嵌插作用减弱或EB在ct-DNA碱基对之间的嵌入量减少，导致ct-DNA的稳定性降低，热变性温度下降。小分子与ct-DNA相互作用，嵌插结合模式使ct-DNA的热变性温度显著增高，一般为5～8 ℃；静电作用使ct-DNA双螺旋收缩，结构稳定性增加，热变性温度呈上升趋势；沟槽结合模式对ct-DNA的热变性温度影响不大甚至出现下降[17]。由图可看出，肽的加入对ct-DNA-EB体系的热变性温度影响变化均在5 ℃以内，且均使ct-DNA的热变性温度降低，说明肽与ct-DNA的作用方式主要为沟槽模式。

2.4 圆二色光谱

对不同浓度的肽与ctDNA体系的圆二色光谱进行扫描(图5)。从图5可以观察到，ct-DNA的特征CD信号为247 nm处的负峰和275 nm处的正峰，前者由DNA的B型螺旋结构产生，后者由于DNA的碱基堆积引起[18]。随着Tyr-Tyr-Tyr-Tyr和Tyr浓度的不断增加，ct-DNA在275 nm处的正峰强度明显减弱且伴随红移。CD信号的明显下降表明肽与ctDNA的相互作用主要发生在与ctDNA碱基之间的作用，肽的加入使ct-DNA碱基对之间的π-π堆积作用受到严重的影响，致使相应的信号峰下降。小分子化合物与ct-DNA发生嵌插模式的作用，会使ct-DNA碱基堆积程度增高，同时使ct-DNA螺旋结构变得松散，导致ct-DNA的CD信号峰变化是247 nm处的负峰收缩，275 nm处的正峰增高[19]，而本实验结果正好与此相反，因此肽与ct-DNA的相互作用不是嵌插模式。与嵌插作用模式不同，小分子结合到ct-DNA的沟槽区后引起碱基的松动[20]，说明肽与ct-DNA的相互作用主要是沟槽模式，且Tyr-Tyr-Tyr-Tyr与ct-DNA的作用比Tyr强。

3 结 论

本文利用固相合成法合成了纯度较高的酪氨酸四肽，并通过荧光光谱法、紫外光谱法、圆二色光谱法对Tyr-Tyr-Tyr-Tyr和Tyr与ct-DNA的作用方式进行了考察。结果表明Tyr-Tyr-Tyr-Tyr和Tyr与ct-DNA以沟槽方式与ct-DNA发生相互作用，且酪氨酸四肽与ct-DNA的作用强于酪氨酸。

[1] Lauren C S,Robert A H.Neuropharmacology,2007,53：791-800.

[2] Li H,Yu Y Y,Hu X，Cao S W.Spectrosc.SpectralAnal.(李华，余燕影，胡昕,曹树稳.光谱学与光谱分析),2008,28(8):1905-1909.

[3] Clareand D A,Swaisgood H E.J.Dairy,2000,82(1):1187.

[4] Li H,Zhao W J,Cao S X,Lu K,Zhao Y F.Chem.J.Chin.Univ.(李红，赵文杰，曹书霞，卢奎，赵玉芬.高等学校化学学报),2004,25(10):1866-1868.

[5] Chan W C,White P D.OxfordUniversityPress,2000,38(6):61-62.

[6] Li R,Lu K,Ma L,Cao S X,Zhao Y F.Chin.J.Anal.Lab.(李锐，卢奎，马丽,曹书霞，赵玉芬.分析试验室),2007,26(9):21-25.

[7] He J X,Jiang C Q,Gao M X.Spectrosc.SpectralAnal.(贺吉香，江崇球，高明霞.光谱学与光谱分析),2003,23(4):755-758.

[8] Lu Y J,Zhang R R,Du Z Y，Fang Y X,Zhang K.Chin.J.Spectrosc.Lab.(卢宇靖，张瑞瑞，杜志云，方岩雄，张焜.光谱实验室),2011,28(4):1565-1569.

[9] Jin L,Yang P,Li Q S.Chem.J.Chin.Univ.(靳兰，杨频，李青山.高等学校化学学报),1996,17(9):1345-1348.[10] Yang G J,Xu J J,Chen H Y.Chem.J.Chin.Univ.(杨功俊，徐静娟，陈洪渊.高等学校化学学报),2004,25(7):1235-1239.

[11] Han B X,Zhang H,Wu F Y.Chin.J.Anal.Lab.(韩丙星，张华，吴芳英.分析试验室),2012,31(12):1-4.

[12] Zhao D X,Sun J,Zhu Q C，Lu K.Chem.J.Chin.Univ.(赵东欣，孙静，朱其丛,卢奎.高等学校化学学报),2013,34(9):2114-2119.

[13] Long E C,Barton J K.Acc.Chem.Res.,1990,23:271-273.

[14] Lu K,Cheng H L,Ma L，Zhao D X,Yang L R,Zhao Y F.Spectrosc.SpectralAnal.(卢奎，成红丽，马丽,赵东欣，杨亮茹，赵玉芬.光谱学与光谱分析),2010,30(1):146-149.

[15] Ma L,Zhao D X,Ren H P，Lu K.AsianJ.Chem.,2011,23(5):2020-2022.

[16] Guan X,Liu J,Su X N.J.Instrum.Anal.(管骁，刘静，苏淅娜.分析测试学报),2014,33(10):1116-1122.

[17] Guo Y H,Chen X L,Zhang T,Qu L B,Zhao Y F,Yu Y Z.Spectrosc.SpectralAnal.(郭玉华，陈晓岚，张婷，屈凌波，赵玉芬，郁有祝.光谱学与光谱分析),2006,26(3):475-479.

[18] Zhang G W,Wang L H,Zhou X Y，Li Y,Gong D M.J.Agric.FoodChem.,2014,62:991-1000.

[19] Li J X,Zhao J Q,Yin X F,Sun C J,Chen J H,Zheng L,Wang X R.J.Instrum.Anal.(李景喜，赵金泉，尹晓裴，孙承君,陈军辉，郑立，王小如.分析测试学报),2016,35(6):668-673.

[20] Yang W,Yuan F,Gao Y X.Spectrosc.SpectralAnal.(杨伟，袁芳，高彦祥.光谱学与光谱分析),2015,35(1):184-188.

Studies on Interaction of Tyr-Tyr-Tyr-Tyr with ct-DNA

SUN Zhi-jie1,2,LÜ Ming-xiu1,2,LU Kui2*，DUAN Bing-chao1,LIU Guang-bin1

(1.College of Chemistry and Molecular Engineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001，China;2.School of Material and Chemical Engineering,Henan University of Engineering,Zhengzhou 450007，China)

A model peptide,Tyr-Tyr-Tyr-Tyr(YYYY),was synthesized by Fmoc solid-phase methods,purified and separated by reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC),and characterized by ESI-MS analysis.The interaction of peptide with calf thymus DNA(ct-DNA) was investigated by UV-Vis absorption spectra,circular dichroism(CD) and fluorescence spectra.The results showed that,with the increase of peptide concentration,there were a hyperchromic effect on UV spectra,a remarkable fluorescence quenching and a red shift of CD.It is possible that Tyr-Tyr-Tyr-Tyr and Tyr might interact with ct-DNA via the groove binding mode.The interaction between Tyr-Tyr-Tyr-Tyr and ct-DNA,compared with that between Tyr and ct-DNA,is more stronger.

Tyr-Tyr-Tyr-Tyr;ct-DNA;interaction;Fmoc solid-phase methods

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.017

2016-07-07；

2016-09-28

国家自然科学基金项目(21572046)；河南省教育厅自然科学基金项目(14A150017)

*通讯作者：卢 奎,博士，教授，研究方向：有机化学与化学生物学研究，Tel：0371-62509959,E-mail：lukui126@126.com

O657.3；O629.72

A

1004-4957(2017)01-0101-06