木尼热·阿布都艾尼，吐尔洪·买买提，博塔·拜合提汗，陈 露

(新疆大学 化学化工学院 石油天然气重点实验室， 新疆 乌鲁木齐 830046)

中空纤维三相液相微萃取-薄层色谱分离同步荧光法测定酱油中的色胺含量

木尼热·阿布都艾尼，吐尔洪·买买提*，博塔·拜合提汗，陈 露

(新疆大学 化学化工学院 石油天然气重点实验室， 新疆 乌鲁木齐 830046)

以三相中空纤维液相微萃取(HF-LPME)作为样品前处理方法，结合薄层色谱分离，同步荧光光谱法测定酱油中色胺的含量。通过单因素实验确立的萃取最优条件为：样品溶液pH值为12.0，正辛醇为萃取溶剂，0.1 mol/L的HCl为接受相，搅拌速度为590 r/min，萃取时间为60 min；取20 μL接受相进行TLC分析，样品点用异丙醇溶解后离心分离；采用同步荧光在λem=350.4 nm处进行定量分析。在最佳萃取条件下，方法的线性范围为0.32～50 mg/L(r>0.978 0)，检出限(S/N=3)为0.32 mg/L。酱油样品的加标回收率为87.5%～107.7%，相对标准偏差(RSD)不大于6.6%。该方法操作简单、绿色高效、灵敏度高，可用于酱油中色胺的快速准确测定。

中空纤维三相液相微萃取；薄层色谱；色胺；酱油；荧光光度法

色胺(吲哚-3-乙胺)是一种吡咯环C3有亲电取代基的低分子量(160.2 g·mol-10)吲哚衍生物[1]。它是氨基酸在氨基酸脱羧酶的作用下，脱去羧基而生成[2]的生物胺[3-5]。微量存在于哺乳动物大脑皮层，在中枢神经系统和胃肠道起神经递质和神经调制的作用。酱油是传统的发酵食品，是我国以及亚洲人民饮食中重要的调味品，其安全性与人类健康密切相关。酱油在长期发酵过程中很容易产生生物胺，导致酱油潜在的不安全性。GB/T 5009.208-2008标准[6]中指出了酱油等调味品中色胺的限量范围(3 μg/kg)，因人体摄入含量超标时会引起皮疹、偏头痛、高血压和低血压等症状引起了全世界的关注。因此，建立酱油中色胺含量的简单、快速、高灵敏的分析方法具有重要意义。

色胺常用的分析方法有高效液相色谱法[4-6]、HPLC-MS/MS[7]、胶束液相色谱法[8]和HPLC-DAD[9]等。中空纤维液相微萃取(HF-LPME)[10-11]是一种新型样品前处理技术，集萃取、富集、浓缩于一体，具有富集倍数高、样品净化能力强、有机溶剂消耗少、快速、灵敏等优点，且一次性使用聚丙烯中空纤维还可避免萃取中的交叉污染，已被广泛应用于食品[12-13]、环境[14]和医学等领域。中空纤维液相微萃取主要有两相液液微萃取和三相液液微萃取两种模式[15]，其中三相模式经历了两次萃取与富集，给体相中的目标分析物首先被萃取到中空纤维壁孔中的有机相，再被反萃取到中空纤维空腔内的接收相。

薄层色谱(TLC)是一种传统的分离能力强、斑点集中、显色方便、时间短、易普及的分离分析方法。荧光分光光度法是灵敏度高、选择性强、使用简单、应用广泛的分析方法。液相微萃取可产生微升级萃取液，且TLC也需同等级别体积的样品，将两者联用无需浓缩或稀释步骤，无需专业人员操作，且方法快速、廉价、试样量小、绿色安全。本文通过将中空纤维三相液相微萃取和薄层色谱法联用[16-17]，建立了一种测定酱油中色胺含量的荧光分光光度方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

970CRT荧光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);Accurel Q 3/2聚丙烯中空纤维(Membrana GmbH，Wuppertal，德国；壁厚200 μm，孔径0.2 μm，内径600 μm)。KQ5200B 超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津公司);1810-B 型石英自动双重纯水蒸馏器(上海市中晨数字技术设备有限公司);pH 211型酸度计(HANNA instruments)，HC-2062型高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);磁力搅拌器(法国，IKA color squid)。

色胺(百灵威科技有限公司);HCl，NaOH(分析纯，杭州萧山化学试剂厂);正辛醇(分析纯，Fisher公司);氯化钠、乙醇、异丙醇、正丁醇、甲醇、丙酮、二氯甲烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);薄层色谱板；二次蒸馏水(自制)。

图1 中空纤维液相微萃取装置示意图Fig.1 The equipment used in hollow fiber liquid phase microextraction

图2 色胺的同步荧光光谱图Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of tryptamine with different concentration tryptamine(a-f):0.5,1.0,2.0,4.0,10.0,20.0 mg/L; λem=350 nm,Δλ=55 nm

图3 样品溶液的pH值对色胺接收相荧光强度的影响Fig.3 Effect of pH value of sample solution on fluorescence intensity of tryptamine

1.2 中空纤维液相微萃取

准确量取6 mL酱油样品置于图1所示的样品瓶中，加入3.4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，调至pH 12.0。将中空纤维切成8.0 cm长的小段，放在丙酮中超声10 min以去除表面杂质，取出，用N2吹干。在正辛醇中浸泡5 min，使纤维孔壁充满正辛醇，取出，向中空纤维管内定量注入一定浓度的HCl溶液作为接受相，再将中空纤维迅速浸入样品溶液中，两端密封，开启磁力搅拌器搅拌60 min。萃取结束后，取20 μL中空纤维管内的接受相进行TLC分离，同体积的色胺标准溶液对比点样，以二氯甲烷-甲醇-氨水(90∶9∶1)进行色谱分离，将色胺点从薄层板上刮下，用一定有机溶剂溶解、超声、离心，上清液用荧光分光光度计在200～555 nm范围内以Δλ=55 nm进行同步扫描。

2 结果与讨论

2.1 TLC分离及荧光检测条件的确定

2.1.1 同步荧光检测同步荧光分析法和常规荧光分析法相比，具有简化谱图，减少光谱重叠，提高选择性和灵敏度，以及减少光散射干扰等优点。本文采用恒波长同步荧光法，设Δλ分别为35，45，55，65 nm，在λex=200～500 nm范围进行色胺的荧光发射光谱扫描，结果显示Δλ=55 nm时灵敏度最高，峰形尖锐(图2)，因此选择Δλ=55 nm。而且在0.5～20 mg/L以350.4 nm的荧光强度梯度增大，因此，本实验选择最佳检测波长为350.4 nm。2.1.2 TLC分离条件的确定考察了正辛醇、乙醇、异丙醇、正丁醇和甲醇5种有机溶剂对洗脱薄层色谱板上的色胺及测定荧光的影响。用30 mg/L色胺NaOH溶液进行萃取后，取出20 μL接受相用HCl溶液点样进行TLC色谱分离，将斑点收集用有机溶剂洗脱测定荧光强度，用空白斑点进行对比。测得正辛醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、甲醇色胺斑点和空白斑点的荧光强度差值分别为28.083，115.081，143.438，125.591，96.678。因此实验选择异丙醇为最优溶剂。

2.2 HF-LPME条件的优化

2.2.1 分配系数的测定分配系数(Ka/d)是反映化合物在水相和有机相之间转移能力的重要参数。本文考察了色胺在两相间的分配，首先用等体积的正辛醇萃取30 mg/L的色胺NaOH溶液(pH 12.0)，萃取后，取有机层和NaOH供体相，在λmax=280.0 nm处测定吸光度。然后在有机层中加入等体积的HCl(0.1 mol/L)反萃取，有机层和HCl接受相在λmax=280.0 nm处测定吸光度。根据分配系数的定义Ka/d=Korg/d×Ka/org，式中Ka/d为分配系数，Korg/d指萃取达平衡时分析物在有机相的浓度与分析物在样品中浓度的比值，Ka/org指萃取达平衡时分析物在接受相中的浓度与分析物在有机相中浓度的比值。由计算可知，Korg/d=19.12，Ka/org=376.86，分配系数为7 205.56，Korg/d较小说明色胺在有机相中的溶解度较小，但Ka/org相当大，说明色胺在接受相中的溶解度很大，其在接受相具有很好的分配，理论推测该体系能够用于色胺的萃取富集。

2.2.2 萃取溶剂的选择在HF-LPME中，萃取溶剂应满足以下条件：①难溶于水；②使待测物在样品溶液和受体溶液两相的分配系数K值较大；③与萃取纤维有良好的亲和性，从而使萃取溶剂充满纤维孔。本实验考察了甲苯、正丁醇、二氯甲烷和正辛醇对色胺的萃取效率。实验结果显示，甲苯和二氯甲烷对色胺的溶解性不好，正辛醇对色胺的萃取效率高于正丁醇，故本实验选择正辛醇为萃取溶剂。

2.2.3 样品pH值的影响考察了样品pH值在9.0～13.0范围内对酱油中色胺萃取效率的影响(图3)。结果表明，随着pH值的增加，荧光强度逐渐增大，这是由于色胺的pKa值为7.6，溶液pH值的增大可使色胺在样品中以分子形式存在，降低了其在水中的溶解度，增加了两相中的分配系数，从而提高了有机相正辛醇对样品中色胺的萃取效率[18]。实验结果显示，pH值为12时荧光强度达到最大值，萃取效果最好。继续增大pH值，萃取效率反而降低，因此实验选择最佳pH值为12。

2.2.4 接受相pH值的影响在萃取样品中色胺浓度为30 mg/L，样品pH值为12，正辛醇作为有机相，萃取时间为60 min条件下，考察了接受相HCl溶液浓度为0.01，0.05，0.1，0.5 mol/L(对应pH值分别为2.0，1.3，1.0，0.3)时对酱油中色胺萃取效率的影响。结果表明，当接受相HCl溶液浓度为0.1 mol/L时，色胺的萃取效率最高。因此，实验选择接受相HCl溶液的最佳浓度为0.1 mol/L。

2.2.5 搅拌速率的影响在HF-LPME中，搅拌样品溶液使纤维外侧的样品溶液不断更新，可缩短至萃取平衡所需的时间，从而提高萃取效率。本实验考察了不同搅拌速率(200，400，430，460，490，590 r/min)对萃取效率的影响。结果发现，适当提高搅拌速率可以明显提高萃取效率。但搅拌速率过快时，溶液中会产生气泡附着在中空纤维膜上阻碍传质过程，还可能会加快有机相的扩散损失。故选择最佳磁力搅拌速率为590 r/min[19]。

2.2.6 萃取时间的影响考察了萃取时间(20，40，60，80，100 min)对萃取效率的影响。结果表明，萃取时间在0～60 min之间时，色胺的萃取效率随萃取时间的延长而增大；60 min后继续延长萃取时间将导致有机膜的不稳定性，从而导致萃取溶液的损失及萃取效率的降低，故选择萃取时间为60 min。

2.2.7 盐加入量的影响考察了样品溶液中添加不同质量NaCl对色胺萃取效果的影响。结果显示，在NaCl加入量分别为0，0.5，1.0，2.0 g时，色胺的荧光强度分别为331.48，327.329，254.403，207.525。表明在酱油生产过程时已加入了食用盐，此时样品本身的粘度较大，继续外加NaCl反而导致萃取效率下降。这是由于NaCl的加入导致样品溶液的黏度增大，使得色胺与盐离子之间的静电作用力增强，从而导致其传质能力降低，并最终导致萃取效率降低，因此本实验不加入NaCl。

2.3 线性范围、检出限与富集倍数

2.3.1 方法的线性范围与检出限准确吸取色胺标准储备液用超纯水稀释成浓度范围为0.32～50 mg/L的系列标准溶液，在最优条件下对酱油样品进行梯度加标三相微萃取，并联用薄层色谱法，扣除背景噪音后绘制标准曲线。结果显示，色胺在0.32～50 mg/L范围内具有良好的线性(图2插图)，其线性方程为y=7.053x- 8.677，相关系数为0.978 0；检出限(S/N=3)为0.32 mg/L。

2.3.2 富集倍数富集倍数(EF)为萃取后接受相中分析物的浓度与萃取前样品中分析物的起始浓度之比。选择3 mg/L色胺溶液(pH 12.0)进行EF的考察。在最优条件下平行测定3次，得到EF为87.56，表明在本实验的优化条件下，中空纤维三相微萃取对于酱油中的色胺具有良好的富集能力。

2.4 酱油样品含量及加标回收率的测定

为验证方法的可靠性，选取2种市售袋装酱油(七一酱园和笑厨)，使用三相微萃取-联用薄层色谱法进行含量测定，每1样品平行测定3次，测得2种样品中色胺的平均浓度分别4.45 mg/L和4.62 mg/L。

采用笑厨瓶装酱油进行加标回收实验以验证方法的准确度。加标浓度分别为10，30，50 mg/L，每个浓度在最优的萃取条件下平行测定3次，测得回收率分别为87.5%,107.7%和94.8%，相对标准偏差(RSD)分别为2.1%，5.5%和0.57% 。表明该法具有较高的准确度和精确度。

2.5 重复性实验

配制加标30 mg/L的色胺酱油样品，用最优的萃取条件进行三相中空纤维微萃取，以同样的条件，进行重复性实验(n=6)，测定值的RSD为4.6%，表明本方法具有良好的重现性。

2.6 测定方法对比

将本方法测定酱油中色胺含量的结果与MLC[3]，UPLC-MS/MS[7],HPLC[20]等高端仪器测得的结果对比(表1)，结果表明，虽然本方法的回收率、检出限和RSD不如UPLC-MS/MS好，但与HPLC相当。说明本方法获得数据不仅可与HPLC等高端仪器测得的数据相媲美，而且具有操作简单，无需昂贵仪器，可在普通实验室[21]实现测试、易于推广等优点。

表1 HF-LPME与其它方法的对比

3 结 论

本文基于中空纤维三相萃取(HP-LPME)联用薄层色谱及同步荧光光谱检测技术，建立了酱油中色胺含量的分析方法。在最佳萃取条件下，方法的线性范围为0.32～50 mg/L；检出限为0.32 mg/L；加标回收率不小于87.5%。本方法操作简便，有机溶剂用量少，环境友好，具有突出的样品净化能力，且成本低，无需昂贵的仪器，可在普通实验室进行测定，易于推广[22]。

致谢:感谢国家自然科学自然基金的资助，感谢再帕尔·阿不力孜教授对本文的修改当中的热心帮助。

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Synchronous Fluorescence Determination of Tryptamine in Soy Sauce Using Three-phase Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction Coupled with Thin-layer Chromatography

Munira·ABUDUANI,Turghun·MUHAMMAD*,Bota·BAHITHAN,CHEN Lu

(College of Chemistry & Chemical Engineering,Key Laboratory of Oil and Gas Fine Chemical,Educational Ministry of China,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

A novel method of hollow fiber liquid phase microextraction(HF-LPME) coupled with thin-layer chromatography was developed for the synchronous spectrofluorimetric determination of tryptamine in soy sauce.The optimum extraction was achieved by adjusting pH value of sample solution to 12.0,using 1-octanol as organic extraction solvent,and 0.1 mol/L HCl as the acceptor phase,and stirring the solution at 590 r/min for 60 min.After extraction,20 μL portion of accepter phase was applied for TLC separation,and the analyte spot was washed off with isopropanol.The quantification analysis of tryptamine was performed with synchronous fluorescence spectra at 350.4 nm.Under the optimum conditions,the calibration curve showed a good linearity in the range of 0.32-50 mg/L(r>0.978 0).The detection limit was 0.32 mg/L.The spiked recoveries from soy sauce samples were in the range of 87.5%- 107.7% with RSDs not more than 6.6%.The proposed method was simple,sensitive,green and accurate,and was suitable for the determination of tryptamine in soy sauce.

hollow fiber three-phase liquid phase microextraction;thin-layer chromatography;tryptamine;soy sauce;fluorophotometry

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.014

2016-07-21；

2016-08-10

国家自然科学基金资助项目(21365020,21565025)

*通讯作者：吐尔洪·买买提，博士，教授，研究方向:分析化学，Tel:0991-8582654,E-mail:turghunm@sina.com

O657.7;O623.732

A

1004-4957(2017)01-0086-05