周林宗，王干珍，易晓明，朱丽琴，彭君

（1. 国土资源部长沙矿产资源监督检测中心，湖南长沙，410007；2. 楚雄师范学院，云南楚雄，675000）

光催化合成银纳米簇对半胱氨酸的检测

周林宗2，王干珍1，易晓明1，朱丽琴1，彭君1

（1. 国土资源部长沙矿产资源监督检测中心，湖南长沙，410007；2. 楚雄师范学院，云南楚雄，675000）

以木瓜蛋白酶为模板，通过光催化法合成了光学性质稳定、生物相容性好的银纳簇。研究发现，将一定浓度的半胱氨酸加入银纳米簇和银离子的混合溶液后，混合溶液在365 nm处会出现一个等离子共振吸收峰，且与半胱氨酸的浓度有良好的线性关系。因此，建立了半胱氨酸的紫外吸收光谱分析法，实现了0.5 μM～60.0 μM浓度范围内半胱氨酸的定量测定，检出限达0.5 μM。这种检测方法具有良好选择性，常见的生物小分子均不会对检测造成影响。

银纳米簇；光催化；紫外分光光度法；半胱氨酸

引言

类似于金银纳米粒子等贵金属纳米粒子，因具有特殊光学性质而引起人们关注，并被广泛应用到生物标记、细胞成像[1]、癌症临床诊断和治疗[2]等各个领域。纳米粒子是20世纪80年代中期发展起来的一种尺寸处于原子簇和宏观物体交界过渡区域的一类特殊微粒[3]。由于纳米颗粒具有量子效应、表面效应、小尺寸效应[4]以及“宏观量子隧道效应”[5]，从而呈现出优良的光学性质[6]、电学性质和良好的生物相容性[2]等。目前，合成银纳米粒子的方法有化学合成法[7,8]、种子培养法[9]、微乳液培养法[10]、辐射法[11]、超临界流体法[12]等，但是这些方法都要用到大量有毒有机试剂和还原剂，会对环境造成一定影响。另外，物理方法需要先进设备和严格条件控制。一些作为模板分子的天然产物虽可用来合成银纳米粒子，但是时间控制以及严格的合成条件也给合成带来了挑战。因此，建立一种简单、快速及绿色的合成银纳米颗粒的方法令人期待。

半胱氨酸是广泛存在于生物系统内的一种具有还原性基团琉基(-SH)的氨基酸[13]。半胱氨酸在人体内具有重要作用，它是通过二硫键支撑蛋白质的二级结构而与蛋白质分子作用，从而具有许多包括新陈代谢等的生物功能[14]。传统的检测半胱氨酸的方法有高效液相色谱法、荧光光谱法[15]和电化学伏安法等。然而，这些方法需要昂贵复杂的设备，操作复杂、费时，从而限制了其应用，因此建立一种简单、快速、选择性好的方法来检测半胱氨酸具有重要意义。

综合上述考虑，以木瓜蛋白酶为模板，利用光催化法合成了光学性质稳定、生物相容性好的银纳米簇，并根据纳米簇等离子共振吸收峰变化来检测半胱氨酸（Cys），这是一种快速简单、绿色环保、低成本的新方法。首先，在紫外灯光照的情况下光催化合成银纳米簇，然后加入半胱氨酸，银纳米簇在365 nm处会出现一个等离子共振吸收峰，且在365 nm处的吸光度变化与半胱氨酸的浓度有良好的关系，在0.5 μM～60 μM有很好的线性范围，最低检测限为0.5 μM。此外，选择性明显提高，其他生物小分子，包括氨基酸、葡萄糖、多巴胺等，均对检测无干扰。基于上述现象，最终建立了基于光催化合成银纳米簇紫外可见分光光度法对半胱氨酸的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

银纳米粒子溶胶的紫外-可见吸收光谱是通过UV-2550紫外-可见分光光度计（日本，岛津）用10 mm×2 mm宽的石英比色皿测得；银纳米粒子的形态和大小使用JEM-2100高分辨率透射电子显微镜（日本电子公司，日本）观测；制备Ag（Ⅰ）-木瓜蛋白酶化合物的搅拌器使用SZCL-2A 数显智能控温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；紫外光照使用ZF-1型三用紫外分析仪（上海骥辉科学分析仪器有限公司）3 W灯进行光照实验；QL-901漩涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）用于溶液混匀；实验中缓冲溶液的pH是通过PHS-25型pH计（上海雷磁仪器厂）测定。

实验所使用的试剂木瓜蛋白酶（国药试剂化学试剂有限公司）、L-半胱氨酸（国药集团化学试剂有限公司，上海）、储备液置于4℃冰箱避光保存、AgNO3（99.999 5%，Alfa Aesar）、酪氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、葡萄糖。其他化学试剂均为分析纯，实验中所用的水为超纯水（电阻率18.25 MΩ）。

1.2 紫外光催化合成木瓜蛋白酶包裹的银纳米粒子

实验使用王水洗过的玻璃仪器，在室温下移取0.3 mL，50 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液于10 mL圆底烧瓶中，在均匀搅拌下快速加入新配制的2.4 mL 10 mM的AgNO3溶液，快速搅拌10 min 后，将该混合溶液转移到5 mL的石英比色皿里，在365 nm紫外光照射30 min，溶液颜色由无色变为浅棕黄色。然后将溶液转移到试剂瓶中，在4℃的冰箱里储存备用。

1.3 半胱氨酸检测

紫外分光光度法检测半胱氨酸：首先，将50 μL的银纳米溶胶加入到1.5 mL的离心管中，然后加入不同体积的半胱氨酸（0.1 mM）到反应体系中，快速震荡30 s后，紧接着加入（20 mM，pH=5.6）B-R缓冲定容到1 000 μL，在漩涡仪上摇匀。实现用紫外分光光度法对半胱氨酸的检测。

2 结果与讨论

2.1 银纳米簇的表征

金属纳米粒子在紫外可见光区有吸收带或吸收区，这是由等离子共振激发或者电子跃迁所形成的，这是纳米粒子尺寸效应的表现，在块体中是不存在的，而且银纳米粒子的紫外吸收峰一般在415 nm左右。因此观察银纳米粒子的光学现象非常有意义。合成的银纳米簇通过紫外吸收光谱和扫描电镜（TEM）来表征（如图1）。银纳米簇最大吸收波长在420 nm处。从TEM图中看出制备的银纳米簇的外观基本为球形，粒度分布均匀，颗粒粒径小，粒径大部分小于5 nm。

图1 木瓜蛋白酶稳定银纳米簇的紫外吸收光谱图

2.2 半胱氨酸检测实验条件优化

本实验利用紫外光催化合成的银纳米簇是首次报道的，实验中对银纳米簇检测半胱氨酸的检测条件进行优化，主要优化了缓冲溶液和反应体系的pH值。

2.2.1 缓冲溶液的选择

为了得到稳定的紫外吸收值，在相同银纳米簇里分别加入相同浓度不同种类的缓冲溶液，然后再加入30 μM的半胱氨酸，反应后扫描反应体系的紫外吸收光谱，对比365 nm处的吸收值。从实验结果可以看出（如图2所示），B-R缓冲条件下在365 nm处的紫外吸收增强得最多，所以选择的缓冲溶液为B-R缓冲。

图2 在365 nm处不同的缓冲溶液检测半胱氨酸的紫外吸收值

实验条件：银纳米簇（通过木瓜蛋白酶估算）1.112 mg/mL，Ag+浓度：1.78 mM，半胱氨酸：30 μM，缓冲溶液浓度：20 mM，pH=7.0，反应时间：20 min，反应温度：25 ℃。

2.2.2 pH值的优化

缓冲溶液的酸度对半胱氨酸检测的影响，实验中在银纳米粒子和半胱氨酸浓度不变的情况下，通过改变加入不同pH值的B-R缓冲溶液来控制反应体系的酸度。pH值的酸度范围是4～10，实验结果如图3所示。随着pH值的增加，365 nm处的吸收峰强度明显增强，当反应的pH为8时，365 nm处的紫外可见吸收值最强，有利于对半胱氨酸的检测，所以最终选择检测半胱氨酸时使用pH为9的B-R缓冲溶液。

图3 不同pH检测半胱氨酸在365 nm处的紫外吸收值

实验条件：银纳米簇：8 mg/mL；半胱氨酸：30 μM，反应时间：20 min，反应温度为25 ℃。

2.3 选择性实验

为了考察方法的选择性，实验选用多种氨基酸、葡萄糖、多巴胺等进行了研究。结果如图4所示，可以得出具有较强还原性的1.5 mM多巴胺（DA）和葡萄糖（Glu）与银纳米团簇反应后会引起体系吸光度增加很少，这说明本方法有较好的选择性。

图4 不同物质与银纳米簇反应在365 nm处的吸光度与空白样品吸光度的比值

实验条件：银纳米簇：3.2 mg/mL，半胱氨酸的浓度为30 μM，其他物质的浓度为1.5 mM，反应时间为20 min。

2.4 光谱法对半胱氨酸的检测

在最佳实验条件下，向银纳米簇溶液中加入不同浓度的半胱氨酸，当半胱氨酸的浓度不断增加，如图5（a）所示体系在365 nm 处的紫外吸收峰逐渐增强，且其吸光度值与半胱氨酸浓度具有良好的线性关系（如图5（b）所示），线性回归方程为A/A0= 0.970 + 0.137 C，R2= 0.996 7，检测下限为0.5 μM。

图5 光谱法对半胱氨酸的检测

2.5 加标回收实验

为了检验方法的可行性，采用加标回收实验，结果如表1所示。可以看出此方法用来检测半胱氨酸是可靠的。

表1 半胱氨酸分析结果

3 结论

以木瓜蛋白酶为模板，通过光催化法合成了光学性质稳定、生物相容性好的银纳米簇，并根据纳米簇的等离子共振吸收峰变化来检测半胱氨酸（Cys），这是一种快速简单、绿色环保、低成本的新方法。这种方法首先在紫外灯存在的情况下光催化合成银纳米簇，然后加入半胱氨酸，在365 nm处会出现一个等离子共振吸收峰，且在365 nm处的吸光度变化与半胱氨酸的浓度有良好的线性关系，在0.5 μM～60.0 μM有很好的线性范围，最低检测限为0.5 μM。该检测方法对半胱氨酸具有高选择性。基于此现象，最终建立了基于光催化合成银纳米簇紫外可见分光光度法对半胱氨酸的检测。

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彭君(1981-)，通信作者，男，湖南人，博士。主要研究方向：光谱分析。

E-mail: pengjun6539@126.com

Photocatalytic Synthesis of Silver Nanoclusters for Detection of Cysteine

ZHOU Lin-zong2, WANG Gan-zhen1, YI Xiao-ming1, ZHU Li-qin1, PENG Jun1

(1. The Ministry of Land and Resources of Changsha Mineral Resources Supervision and Inspection Center, Changsha, Hunan,410007, China; 2. Chuxiong Normal University, Chuxiong, Yunnan,675000, China)

Silver nanoclusters (AgNCs) with excellent photostability and biocompatibility have been synthesized using photocatalysis method in which papain is used as a template. When cysteine (Cys) with certain concentration is added into mixed solution of AgNCs and silver ions, a strong absorption band near 365 nm could be found in their absorption spectra owing to localized surface plasmon resonance (LSPR) of produced AgNCs. The absorbance changes at 365 nm have a good relationship with Cys concentration. The present assay allows for the sensing of Cys in the range from 0.5 μM to 60.0 μM, with a limit of detection (LOD) as low as 0.5 μM. More importantly, this colorimetric method has high selectivity to Cys. Potential interferes, such as glucose and dopamine will not affect the detection of Cys.

Silver Nanoclusters; Photocatalytic; UV Spectrophotometry; Cysteine

O6

A

2095-8412 (2016) 06-1060-05

10.14103/j.issn.2095-8412.2016.06.001

周林宗(1962-)，男，云南人，副教授。主要研究方向：应用化学。E-mail: zhoulinzong@163.com