吴柱连　张　波　冯贵雪

广西壮族自治区妇幼保健院(南宁，530003)

目前，保存女性生育力的方法主要有卵母细胞冷冻、胚胎冷冻和卵巢冷冻。对于尚未有配偶的女性患者以及由于法律等因素限制不能进行胚胎冷冻的患者来说，卵母细胞冷冻是较好的选择。但是，目前卵母细胞冷冻技术不够成熟，人类卵子冻存的成功率很低，出生率仅为2%[1]。人类卵母细胞对温度的改变非常敏感，在冷冻和解冻过程中,冷冻暴露时间过长和冰晶形成都容易导致纺锤体去极化，从而导致染色单体分离异常而产生非整倍体，甚至导致卵母细胞胞浆过早释放皮质颗粒而使透明带变硬，影响正常受精和胚胎的孵出。胚胎冷冻是目前保存女性生育力较成熟的方法，并已广泛应用于临床，但这项技术无法适用于青春期前及无配偶的女性患者[2]。此外，卵母细胞冷冻和胚胎冷冻两种方法需要消耗一定时间去获得可供保存的卵子和胚胎，并且无法使患者恢复内分泌功能。相比之下，卵巢组织内包含大量对温度的敏感性低，耐受冷冻能力强的未成熟卵母细胞，不易受到冷冻伤害；卵巢组织冷冻保存不需要对卵巢进行药物刺激进行促排卵，不影响肿瘤患者的治疗；卵巢组织移植之后，能在一定时间内发挥生殖内分泌功能，对女性生育力和生殖内分泌功能保存有着重要的意义。

1 卵巢组织冷冻保存与移植技术适用对象及其安全性

2014年美国生殖医学会[3]提出卵巢组织冷冻保存与移植技术的适用对象主要为以下5类：①需要立即行有生殖毒性治疗的恶性肿瘤患者；②对于青春期前患有激素依赖性恶性肿瘤的女性；③患某些良性血液系统疾病(镰状细胞贫血、重型地中海贫血、再生障碍性贫血)，需要行造血干细胞移植治疗的女性；④患有自身免疫病,免疫抑制治疗失败的女性；⑤具有卵巢功能早衰高风险的基因突变患者。不管应用于哪个领域，其安全性问题是影响其推广应用的关键[4]。

1.1 应用于保存肿瘤患者生育力

据统计，在女性癌症患者中，年龄<45岁约占10%，随着近年来医疗水平的不断提高，年轻癌症患者的治愈率已达到>90%[5]。但是，由于卵巢组织对放化疗药物很敏感，放化疗药物的使用很容易导致卵泡凋亡和卵巢间质损伤，从而导致女性生殖内分泌功能减退，甚至卵巢早衰。若闭经持续时间>1年，卵巢功能大多不能恢复[6]。卵巢冷冻移植优点颇多，但其安全性备受争议。已有研究证实，>50%的白血病患者的卵巢组织中可通过PCR方法检出恶性肿瘤细胞[7]。研究表明，白血病、神经母细胞瘤和伯基特淋巴瘤等肿瘤患者卵巢移植具有肿瘤再种植高风险，相对来说，霍奇金淋巴瘤、乳腺癌Ⅰ～Ⅱ期等具有较低的肿瘤再种植风险[8]。提高肿瘤细胞的检出率以保证肿瘤患者卵巢移植的安全性显得尤其重要。因此，鉴别卵巢组织中肿瘤细胞的新标志[9]和新方法[10]的研究已逐渐成为热点。

1.2 应用于延迟女性更年期

已有研究表明，青春期前、儿童放化疗前进行卵巢组织冷冻，虽然放化疗期间已出现卵巢功能衰竭，但是之后可通过卵巢组织移植能够成功诱导青春期[11]。提示了这种通过移植卵巢组织维持激素分泌的“组织激素疗法”( THT)可以提供足够的血清激素水平，在某些情况下能够替代外源性激素疗法。鉴于此，2015年，Anderson等[12]提出了是否能够将卵巢组织冷冻移植技术应用于推迟妇女更年期的问题。这一观点的提出引起了许多学者的关注，也让一部分女性看到了曙光。但是，Von Wolff等[13]却认为，应用卵巢组织移植延迟更年期在技术上是可行的，但是，在从内分泌学角度上这种疗法是可疑的。他认为，与传统的更年期激素疗法(MHT)相比，使用冷冻卵巢组织推迟更年期似乎是一个有趣的选择。但是，诱导妊娠和由THT替换MHT，是两个完全不同的概念，它们的要求不同。首先，MHT需要长期和持续的激素产生，然而，移植物是否真的能够维持至少5年的卵泡生长和内分泌功能尚需被证实。其次，生理激素分泌优于非生理MHT仍是假设。再者，对于那些曾接受子宫切除术的女性来说，不需要孕激素来保护子宫内膜，而只需要雌激素，这样更加有益于健康(心血管系统、乳腺)，这种情况下，THT 疗法中雌激素和孕激素同时分泌反而不利于这部分女性的健康。因此，移植卵巢组织以推迟更年期的适用性还需进一步论证研究。

1.3 应用于原发性卵巢功能不全患者原始卵泡的体外激活

原发性卵巢功能不全是指女性 40岁之前出现卵巢功能提前衰退，临床表现为原发性或继发性闭经、生殖器官萎缩、卵泡刺激素(FSF)和黄体生成素(LH)异常升高、生育力降低甚至丧失。2015年，Suzzuki等[14]报道，通过在培养基中添加PTEN抑制因子和PI3K激活因子处理原发性功能不全患者的卵巢组织，以激活休眠的原始卵泡，随后将卵巢组织进行自体移植，最终获得卵泡生长并妊娠。PTEN基因，是一种抑癌基因，在多种组织中具有抑制肿瘤发生的作用，同时也抑制原始卵泡的激活。有研究报道，特异性敲除PTEN基因后，小鼠卵巢内原始卵泡激活速度增快，卵泡寿命延长[15]。此外，PTEN抑制剂也被发现能够有效地激活新生小鼠卵巢和人类卵巢皮质内的原始卵泡[16]。但是PTEN抑制剂应用的长期安全性尚未得到评估。已有研究表明，颗粒细胞中FOXO1/3和PTEN基因缺失会促进小鼠卵巢颗粒细胞瘤的生成[17]。PTEN 基因本身就是抑癌基因，抑制其表达会不会引发癌症，仍需要更多的研究来证实。

2 改善卵巢组织冷冻效果研究

卵巢组织的冷冻保存和移植是一种理想的保存女性生育能力的方法。然而,迄今为止，卵巢组织的冷冻保存尚缺乏高效、统一和标准的程序。冷冻卵巢组织大小、冷冻保护剂与冷冻保存的方法等均会影响卵巢组织冷冻保存的效果。研究建立优化的冷冻方案，尽量减少卵巢组织冷冻损伤，是生殖力保存成功的重要一环。

2.1 冷冻卵巢组织大小的选择

原始卵泡的代谢速度慢,所含对冷冻损伤敏感的细胞间质较少。相对于成熟卵泡,原始卵泡对冷冻和复苏过程中的冷冻损伤的耐受性更强,是目前卵巢组织冷冻保存的主要对象。原始卵泡占据卵巢皮质卵泡中的绝大部分，主要分布在卵巢皮质内。卵巢皮质片段冷冻及移植是目前研究较广泛的方法，具有取材容易、冷冻保护剂易于渗透、可多次移植且无伦理学限制等特点。但是，卵巢皮质片段因其有限的卵泡数量，无法使患者永久恢复内分泌功能。此外，由于无血管吻合的卵巢皮质片段移植后须经血管重建过程才能恢复血供，使得有限的卵泡数量因缺血缺氧再次遭受损失，严重影响移植后卵泡的存活和卵巢组织的寿命。据报道，因移植后缺血缺氧造成的卵泡损失远远大于冷冻和复苏过程。Aubard等[18]认为，在卵巢冷冻保存过程中，会损失7%的卵泡，移植后新血供建立前还会丧失60%以上的始基卵泡。因此，带血管蒂的整体卵巢冷冻移植的研究被提上日程。理论上，带血管蒂整体卵巢冷冻移植的优势可能在于：通过血管吻合移植术后卵巢可迅速恢复血供，显著减少组织的缺血性损伤；再者，由于整体卵巢携有更多的卵泡，有望长期维持卵巢功能。目前，通过血管吻合的整体卵巢移植在许多动物模型和人体上均获得了成功。而实际临床应用中，由于整体卵巢组织冷冻以及血管吻合技术的操作难度大，限制了该项方法的研究和推广应用。目前尚未有通过整体卵巢冷冻移植技术获得活产儿的报道，而世界范围内已经有60多名卵巢皮质移植出生儿的报道[19]。

2.2 冷冻前处理

常规卵巢冷冻技术中，手术获取卵巢组织后尽快送至实验室进行冷冻保存。然而，有人则提出，冷冻前让卵巢组织经历一段时间预冷，让其有充足的时间为冷刺激做好准备，冷冻效果更好。冷冻保存过程出现的低氧、细胞内Ca2+增加、细胞膜通透性改变、活性氧和膜脂质过氧化增加等负面影响，均会导致磷脂酰丝氨酸易位增加，而Isachenko等[20]研究发现冷冻前在5℃条件下预冷处理24 h卵巢组织发生磷脂酰丝氨酸易位的细胞数均显著少。在其研究中，来自12个患者的卵巢皮质组织被随机分为4组，第1组进行常规慢冷冻；第2组先在5℃条件下预冷24 h，再进行常规慢冷冻；第3组进行常规慢冷冻，随后解冻并进行异种移植至小鼠皮下；第4组先在5℃条件下预冷24 h，再进行常规慢冷冻，随后解冻并进行异种移植至小鼠皮下；第1、2组，解冻后进行检测，第3、4组移植后45 d取出移植物进行检测，发现冷冻前在5℃条件下预冷处理24 h的第2和第4组的卵巢组织发生磷脂酰丝氨酸易位的细胞数均显著少于常规冷冻的第1和第3组。对于此，Isachenko认为一定时间的预冷处理可以提高细胞对冷刺激的适应能力，有利于提高冷冻效果。组织冷冻前长时间预冷为改善卵巢组织冷冻效果的研究提供了新思路，但由于鲜见报道，其有效性仍需要更多研究论证支持。

2.3 冷冻方案的选择

相对于胚胎冷冻和卵子冷冻来说，卵巢冷冻更加复杂。因为卵巢包含卵母细胞、颗粒细胞、间质细胞等不同的细胞类型，使得很难找出一种较合适的保存各类型细胞及细胞间连接的冷冻方案。近年来，随着科技的进步，玻璃化冷冻保存技术得到迅猛发展。玻璃化冷冻成本低廉、过程简单，其迅速的降温过程可以使组织细胞形成一种介于液态和固态之间的“玻璃化状态”，呈高黏度且非晶体,使组织细胞挤压损伤和冻融效应减小,具有巨大的发展潜力。目前，玻璃化冷冻技术已经在卵母细胞、胚胎、卵巢组织冷冻方面都取得了一定的进展，逐渐成为辅助生殖领域的关键技术，具有广阔的发展前景。然而，迄今为止尚未形成一个统一有效的卵巢组织玻璃化冷冻保存体系和统一客观的冷冻复苏效果评价指标。因此，玻璃化冷冻技术还有待于进一步的研究。另有研究则认为,通过慢速程序化冷冻法对女性生殖能力的保存效果稳定，可使卵巢组织得到较好的冷冻保存,复苏后能获得具有生殖潜能的卵巢组织[21]。然而，程序冷冻的仪器昂贵，操作费时，流程繁复，耗液氮的量大，冰晶形成较多。这些冰晶可损伤细胞及细胞间连接结构，极大地影响卵巢组织内部结构和组织活性。此外，在解冻过程中大量冰晶融解产生的冻融效应也会对细胞再次造成损伤。因此采取慢速冷冻法广泛应用于卵巢组织库的建立，尚具有一定局限性。目前，关于慢速冷冻和玻璃化冷冻，哪种方法冷冻卵巢组织效果更好，依然存在争议。一些研究认为，玻璃化冷冻对于生长卵泡的保存效果优于慢速冷冻法[22-23]；而有些研究的观点则恰恰相反[24]；另有研究认为两种方法的冷冻效果没有显著差异[25-27]。但遗憾的是，目前世界范围内通过卵巢冷冻移植技术获得的60名活产儿当中，仅有两名(双胞胎)来自玻璃化冷冻-移植技术。由于目前大部分中心尚未开展玻璃化冷冻项目，再加上许多患者都是在卵巢冷冻后10年左右再进行移植，因此，想要用临床数据来证明玻璃化冷冻的冷冻效果是否优于慢速冷冻还需要很长一段时间。

2.4 冷冻保护剂的选择

目前应用于玻璃化冷冻的冷冻剂有乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)和甘油。EG具有毒性低、渗透快的特性，但玻璃化形成作用较差；DMSO渗透力强且分子量小，但其细胞毒性大。Aubard等[28]通过比较四种冷冻保护剂对卵巢组织冷冻移植后卵泡存活率的影响，结果显示原始卵泡的存活率由高到低依次为EG(83%)、DMSO(74%)、PROH(44%)、甘油(10%)，认为乙二醇冷冻效果更优。但是，Amorim等[29]则认为DMSO和EG的冷冻效果在同一水平上，且均明显优于PROH和甘油。合理地将各种冷冻保护剂成分配伍使用可以提高冷冻效果并同时降低冷冻保护剂的细胞毒性。Sheikhi等[30]将DMSO、EG和PROH三者联合配伍做为冷冻保护剂，对人卵巢组织进行玻璃化冷冻，得到了高达92.31%的形态正常卵泡率。此外，还可以通过添加辅助因子来提高单一冷冻保护剂的冷冻效果。研究发现，羧基化的多聚赖氨酸(Poly-L-Lyine)添加到DMSO中,可有效防止冰晶形成，完好地保护细胞膜，对细胞的冷冻保存效果优于单一的DMSO[31]。此外，抗冷冻蛋白也是一种较佳的冷冻保护剂。抗冷冻蛋白可阻止冰核的形成，抑制冰晶生长，阻止重结晶过程,还可以与细胞膜相互作用进而稳定细胞膜结构。Lee等[32]比较通过比较3种抗冷冻蛋白(FfIBP，LeIBP，typeⅢ)的3种不同浓度(0.1，1，10 mg/ml)对卵泡的冷冻保存效果，发现添加高浓度抗冷冻蛋白均有利于保护卵泡，其中LeIBP的效果最优。可见，AFP在医学上具有诱人的应用前景，但是，由于AFP价格昂贵并尚无法形成规模化生产，限制了其推广应用。

3 结语

在国外，已有许多中心早在十多年前就已经开展了卵巢组织冷冻保存的服务，并且已经建立相当完善的体制和程序。据报道目前全世界已经有60多例卵巢冷冻移植活产儿[19]。然而，由于国内种种条件限制，卵巢组织冷冻保存及其相关下游技术目前还处于临床试验研究阶段，用于临床服务还需更多更深层次的研究和探讨[33]。尽管目前卵巢移植的成功率不容乐观，且尚未形成统一有效的冷冻移植体系，对于肿瘤患者来说尚存肿瘤细胞再种植风险等问题，但是这并不妨碍人们看到其明朗的应用前景，并有信心去继续探索该技术的应用领域，希望能让更多人能够从这项技术中受益。

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