李代军 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

兔皮肤真菌病常见检测方法

李代军 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

兔皮肤真菌病是一种由病原真菌通过侵入动物表皮及毛囊引起动物皮屑增多，脱毛等相关症状的疾病。近年来，兔皮肤真菌病在世界范围内广泛流行，对养兔业发展造成了极其严重的经济损失。在美国、意大利等国家都有兔皮肤真菌病的发生。在国内，黑龙江、山东青岛地区也有该病的发生。

目前，用于兔皮肤病原真菌的鉴定方法主要包括传统的形态学方法和分子生物学方法。现将实验室常用的检测方法阐述如下。

1 传统的形态学方法

1.1 直接镜检法

临床标本的直接显微镜检查是最简单也是最有用的实验室诊断方法。方法是将浅部感染真菌病变标本置于载玻片上，滴加10%的KOH，覆盖玻片后用吸水纸吸去多余液体，显微镜下观察可见皮屑中有菌丝、毛发内部或外部有成串孢子，即可初步诊断为真菌感染。该方法对浅部皮肤病原真菌感染的检测有较大帮助，其优点在于可以在几分钟内完成诊断，简便、快速，阳性结果可以确定为真菌感染。但直接镜检阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断；缺乏种特异性，敏感性低；易与能形成假菌丝的真菌混淆。要确诊应同时采用多种方法进行综合性诊断。

1.2 分离培养

通常用沙堡弱葡萄糖琼脂培养基，在培养基中事先加入氯霉素等抗生素，以防止细菌和其他霉菌生长。病料培养于25～28℃，逐日观察，根据培养基上形成的真菌菌落形态并结合镜检进行种属鉴定。该方法根据真菌在培养基上的生长形态、菌落性状、色泽、生化实验和菌丝及孢子形态等来鉴定病原性真菌的种属，是国内外学者一致认同的兔皮肤真菌病确诊依据，已广泛应用于该病病原的分离与鉴定。但是该方法消耗时间较长，一般需要1～2周；有些非典型分离病菌还需要特殊培养基培养。实验费用高，而且需要多年的实践经验和技术，更重要的是皮肤真菌在培养过程中易受外界因素影响，如：温度变化、化学药物等，可引起菌种的代谢变化及表型特征的改变，干扰真菌菌种的检测。

2 分子生物学方法

近年来，核酸分析技术也逐渐运用到真菌鉴定中，因病原体的基因型比形态特征更具特异性及精确性，不会因外界影响因素 （如温度改变、化学药物）影响而改变，并且敏感度高、快速、简便。而且它不仅能检测出活的致病菌，而且也能检测出死亡的和难以培养的真菌。这些技术包括限制性酶切片断多态性 （RFLP）、DNA序列分析、实时荧光定量PCR和随机扩增多态性DNA(RAPD或AP-PCR)等，已运用到真菌的鉴别、分类学及种系发生学等研究中，其中包括对皮肤病原真菌的研究。

2.1 序列分析

DNA序列测定能够获得DNA分子变异最为本质的信息，对于了解基因结构、表达及分子进化等具有重要意义。以DNA为研究对象是建立在基因序列差异的基础上，所以序列分析是分子生物学研究中最根本的方法。DNA序列分析要求DNA含量及纯度均较高，仪器设备昂贵，操作技术要求高，限制了它在医学真菌研究中的广泛应用。近年来随着经济发展和人员素质的提高，测序已成为医学真菌分类的常用手段。DNA序列分析被认为是真菌鉴定最直接、最明确的指标之一。以往由于DNA序列测定的工作量巨大和放射性危害等缺陷，获得大量的序列资料绝非易事。

2.2 实时荧光定量PCR

RT-qPCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。该技术是对常规PCR技术的革新，其定量和扩增同步进行克服了PCR的平台效应；除加样开盖外，其后完全是闭管操作，减少污染；不需PCR后处理，避免假阳性；可直接监测扩增中荧光信号变化获得定量结果，精确性和灵敏度高；检测速度快，几个反应可同时进行，多色荧光检测；特异性和重复性强；应用范围广，但该方法对DNA质和量的要求较高，实验仪器、试剂价格昂贵，不适宜临床和实验室大量样品的使用。

2.3 核酸杂交技术

这是一个广义的概念。与真菌分类学有关的包括DNADNA/RNA杂交再缔合分析、核酸分子探针杂交等。然而，由于真菌基因组进化方式的原因，使得不同种间DNA重新结合的程度忽高忽低，以至难以确定供试菌之间的相互关系，使得该方法在真菌系统分类研究中的应用受到限制。最常见的结果就是同一真菌种内个体间的DNA杂交百分率高达90%，而关系很密切的种间杂交百分率就极低 (小于20%)，很少有杂交百分率为中等的物种对。因此，DNADNA杂交方法被限制于研究关系很密切的种下类群问题，也常用于帮助划定种的范围。该方法的缺陷是结果不易分析，研究中需要两两比较，相关物种的不同研究结果不易比较，而且需要DNA样品的量较大。

2.4 限制性片段长度多态性 (RFLP)分析

RFLP分析是将真菌基因组DNA用特定限制性内切酶酶解后电泳分离从而获得高度多态性的图谱，原则上只要内切酶选择合适，便对所有真菌均能显示任何分类水平上的多态性和特异性，这一方法己在多种真菌 (包括酵母菌和丝状真菌)中得到应用，方法简便，影响因素少，稳定性高。核糖体ITS区PCR-RFLP分析是区分常见皮肤癣菌有价值的方法。

2.5 随机扩增多态性DNA(RAPD)分析

随机扩增多态性DNA（RAPD）方法是在PCR技术的基础上第一次运用随机引物扩增，寻找多态性DNA片段作为分子标志。因其能迅速扩增未知靶细胞基因片段，获得大量多态性信息，被用于生物分类鉴定和群体生物学研究。RAPD用于医学真菌分类和鉴定能从临床标本中一次性的鉴定到真菌种和型的水平，能清晰分析形态学与生理学相似而遗传特征明显不同的真菌，特别适用于不了解基因组DNA列的真菌，方法简便迅速，结果稳定可靠，重复性好。

2.6 微卫星引物PCR

微卫星引物PCR是以 (GACA)4等寡核苷酸重复序列为引物对真菌的全基因组进行扩增，不同的菌株有其明显的DNA指纹，在真菌菌种鉴定和分类上具有高效、快速等特点，以上研究结果表明，该技术对于病原学诊断、判断感染来源及了解菌种地区分布等流行病学特点具有重要价值。

由此可见，所有的方法都有其优点，都有一定的鉴别皮肤真菌的能力，但又都有其不足。最直接最可靠的鉴别菌种的方法是对特征性扩增条带的序列分析，但这并不适合临床及一般实验室的应用。目前真菌直接镜检、培养仍是临床上检测真菌感染的主要方法。RAPD因其高多态性及方法简单的优点具有较大的发展前景，但仍存在着缺点，需完善提高。现在还不能利用分子性状重建一个最为精确、最为客观的真菌系统进化关系。现在分类多还是以形态学形状和生理学形状为主，以分子为辅的方法。