王 伟，徐双双，郜爱玲，权 伟，卢 珊*，金荷仙

（1温州科技职业学院，温州 325006；2浙江农林大学，临安 311300）

不同因素对大苞鞘石斛原球茎分化的影响

王 伟1，徐双双1，郜爱玲1，权 伟1，卢 珊1*，金荷仙2

（1温州科技职业学院，温州 325006；2浙江农林大学，临安 311300）

选择6-BA、NAA、培养基种类和有机添加物种类等4个因素进行L16（44）正交试验，研究各因素对大苞鞘石斛原球茎分化的影响。结果表明：将无菌播种50 d已突破种皮的原球茎转接于含3 g/L花宝1号+2 g/L蛋白胨+0.2 mg/L NAA+10%马铃薯提取液+20 g/L蔗糖（pH 5.6）的培养基上培养70 d，分化效果最好。6-BA对原球茎分化影响最为显著。

大苞鞘石斛；组织培养；原球茎分化；正交试验

大苞鞘石斛（Dendrobium wardianum）主产于云南腾冲地区，为附生兰，对生境要求苛刻，生长缓慢，种子极小且无胚乳，自然繁殖率低，因观赏价值高、可药用［1］，被盗挖者过度采集，野生资源数量明显下降。针对该现状，对大苞鞘石斛种质资源的保护和研究逐渐引起了各界学者的重视，LUAN等［2］发现1/2MS培养基中添加NAA 0.5 mg/L、20%CW、蔗糖30 mg/L可作为大苞鞘石斛无菌播种培养基；SHARMA等［3］认为，以MS为基本培养基，添加2.5 mg/L硝酸钙可使外植体直接形成丛生芽，添加低浓度的尿素有利于拟原球茎分化为完整植株，继而他成功将大苞鞘石斛拟原球茎制作为人工种子且可全部萌发于MS培养基上［4］；卓孝康等［5］利用正交试验，初步探索了激素和添加物对大苞鞘石斛植株再生的影响；吴元玲等［6］、刘晓东等［7］对大苞鞘石斛原球茎超低温保存技术及其保存中生理生化的变化进行了研究与探讨，为实现长期稳定保存大苞鞘石斛种质资源奠定了基础。

笔者在长期试验中发现，大苞鞘石斛无菌播种育苗周期长于其他石斛种类，培养过程中需要经过多次转接才可顺利成苗，而原球茎分化阶段的继代培养与后期育苗质量及周期长短关系密切。目前，关于不同因素对大苞鞘石斛原球茎分化影响方面的研究甚少。为此，本试验利用6-BA、NAA、培养基种类、有机添加物种类等4个因素设计L16（44）正交试验，研究不同因素对大苞鞘石斛原球茎分化的影响，以期筛选出适宜的培养基配方，为大苞鞘石斛种质资源的保育和开发提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 材料

试验所用原植物采自我国云南腾冲地区，经上海辰山植物园黄卫昌高级工程师鉴定为兰科石斛属大苞鞘石斛（Dendrobium wardianum）的新鲜植株，所用原球茎是经过人工授粉的蒴果无菌播种于无激素B5培养基（椰乳20%，绵白糖20 g/L）50 d所得，挑选处于同一生长期（原球茎已突破种皮并出现芽点）、色泽鲜绿、直径（0.65±0.05）mm，且没有分化的原球茎作为分化试验材料。

1．2 方法

1.2.1 转接方法

材料选取萌发试验中培养50 d后得到的原球茎，利用接种勺在超净工作台上将其取出，并挑选出符合试验条件的原球茎转接于分化培养基上。

1.2.2 培养基设计与培养条件

对6-BA、NAA、培养基、有机添加物等4个因素选取4个水平研究其对原球茎分化的影响（表1）。设计L16（44）正交试验，共16个处理，待检培养基pH 5.6，附加20 g/L蔗糖、7.6 g/L琼脂。培养温度为（23±1）℃，光照强度约2 000 lx，光照时间16 h/d。16个待检培养基处理分别接种8瓶，重复3次。

表1 大苞鞘石斛原球茎分化培养基配方正交试验设计L16（44）Table 1 Orthogonal design scheme L16（44）of the culture media for protocorm differentiation of Dendrobium wardianum

1.2.3 观察记录

培养过程中，每10 d在超净工作台上观查1次原球茎分化情况，并记录原球茎直径（mm）、叶片分化数量、根数等；培养70 d后，将幼苗从瓶内取出，测量株高（mm）、根长（mm）、叶片长度（mm），统计根分化量（%）、叶分化量（%）和平均生根数等6项指标。

平均生根数＝生根根数/生根株数

根分化量＝生根株数/总株数

叶分化量＝已分化叶的株数/总株数

1.2.4 数据统计与分析

采用SPSS 21.0统计分析软件对各观测指标进行相关性分析、方差分析和极差分析。

2 结果与分析

2．1 大苞鞘石斛原球茎分化结果

大苞鞘石斛原球茎（图1a）分化需要较长的时间，接种10 d后，原球茎开始膨大且顶部叶原基隆起，并伴有白色丝状物产生；20—40 d，原球茎直径增至2 mm左右，纵轴生长加快（图1b），40 d时，原球茎已初步分化为幼苗形态，叶片数量1—2片，根≤1条；40—60 d，幼苗多具两叶，部分开始分化第三叶，根系数量1—3条；60 d后分化出第三叶的小苗节间伸长开始进行高生长，且部分幼苗基部产生拟原球茎或丛生苗；培养70 d，原球茎已完全分化为幼苗（图1c）。培养结果（表2）显示，各项观测指标值在不同因素、不同水平培养条件下存在一定差异。

2．2 相关性分析

为了进一步研究6项观测指标之间是否存在相关性，从而有效判断在16个试验组合中原球茎分化效果最优的组合，对正交试验结果进行了相关性分析，结果显示（表3），原球茎分化为苗后的株高、根分化量、平均根数、根长、叶长和叶分化量之间除根分化量与叶长之间无显著性相关关系外，其他各观测指标之间均呈显著正相关，说明各观测指标之间有较强的联系。

图1 大苞鞘石斛原球茎分化过程Fig．1 Protocorm differentiation of Dendrobium wardianum

表2 原球茎分化正交试验结果（n＝3）Table 2 Results of orthogonal test of protocorm differentiation（n＝3）

表3 大苞鞘石斛原球茎分化观测指标的相关性分析（n＝3）Table 3 Correlation analysis of observation index of protocorm differentiation of Dendrobium wardianum（n＝3）

结合以上分析，可将6项观测指标分组进行综合分析：将观测指标株高作为原球茎分化的茎生长状况，反映4个因素对茎生长的促进作用；将根分化量、平均根数和根长3个观测指标综合考虑，反映4个因素对根系发育的影响；将叶长和叶分化量两个观测指标综合考虑，反映4个因素对原球茎叶分化和生长的促进作用。

2．3 不同因素对原球茎分化的影响

2.3.1 不同因素对茎生长的影响

对培养70 d后的6项观测指标进行方差分析，结果（表4）表明，6-BA对原球茎分化高度的影响达到显著水平。如表5所示，比较各因素R值大小可知，4个因素对原球茎分化后株高影响大小排序为6-BA＞NAA＞培养基＞有机添加物。根据各因素水平均值（ki）的大小，可初步推断影响原球茎分化茎生长的最优水平组合为1-2-2-4，即0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA、3 g/L花宝1号+2 g/L蛋白胨和马铃薯提取液。

表4 各培养基配方方差分析Table 4 Variance analysis of each medium formula

表5 不同因素对原球茎分化高度的影响Table 5 Effects of different factors on the height growth of protocorm differentiation of Dendrobium wardianummm

2.3.2 不同因素对根系发育的影响

不同因素对根系发育的影响具有一定的差异性。方差结果显示（表4），6-BA对根长的影响达到显著水平，而4个因素对平均根数和根分化量的影响未达到显著水平。根据各因素R值大小可知（表6），4个因素对根系发育影响强弱表现为6-BA＞有机添加物＞培养基＞NAA。大苞鞘石斛原球茎根分化量及根长的最佳培养配方为1-2-2-4，而水平组合1-3-2-4为影响平均根数的最优组合。

表6 不同因素对原球茎分化根系发育的影响Table 6 Effects of different factors on the root development of protocorm differentiation of Dendrobium wardianum

2.3.3 不同因素对叶分化的影响

由方差分析结果可知（表4），6-BA对原球茎叶分化量的影响达到极显著性水平，而4个因素对叶长指标的影响未达到显著水平。通过比较R值可知（表7），各因素中对大苞鞘石斛叶长起主导作用的为培养基；4个因素影响原球茎叶分化量的主次程度为6-BA＞培养基＞有机添加物＞NAA。对叶长有促进作用的最佳水平组合为1-1-2-4，影响叶分化量的最佳配方为1-1-1-4。

表7 不同因素对原球茎分化叶分化的影响Table 7 Effects of different factors on the leaf differentiation of Dendrobium wardianum protocorm

3 讨论与结论

不同因素对大苞鞘石斛原球茎分化的影响差异较大。大苞鞘石斛原球茎分化只需单独添加低质量浓度的NAA（≤0.5 mg/L），且当浓度变化时会对原球茎不同部位的分化有着促进作用。曾宋君等［8］研究也认为NAA质量浓度为0.2—0.5 mg/L最适宜美花石斛、密花石斛等5种石斛胚萌发和成苗；卓孝康等［5］的研究也表明较高质量浓度的生长素（NAA≥0.5 mg/L）不利于大苞鞘石斛原球茎叶芽分化。本试验表明，添加马铃薯提取液对原球茎分化的叶长、根分化量和高等指标促进作用最为明显。这与喇叭唇石斛原球茎分化（添加10%马铃薯汁）、霍山石斛拟原球茎分化（添加8%马铃薯提取液）等研究结果基本一致［9-10］。

本试验发现，大苞鞘石斛原球茎在分化过程中，B5培养基和3 g/L花宝1号+2 g/L蛋白胨培养基在原球茎分化过程中会直接分化出不定芽，而B5+2 g/L蛋白胨培养基较易产生团状拟原球茎，且剥离后可作为继代扩繁的原始材料。陈娜等［11］通过电镜观察也发现，大苞鞘石斛无菌播种的原球茎分化过程中，有低比例的愈伤组织出现，愈伤组织可分化形成拟原球茎或直接分化成芽。利用该特性，可以更便捷地诱导和获得拟原球茎，提高诱导成功率，节省组培成本和时间。

本研究表明：（1）6-BA对原球茎分化影响最为显著，且为抑制作用。根据4个因素对观测指标影响的主次程度可知，对茎、根、叶三部位分化与生长促进作用最强的因素分别为NAA、有机添加物和培养基。（2）从各因素不同水平组合对原球茎的茎、根、叶的优选组合来看，NAA为0—0.5 mg/L时，对茎、根及叶的分化均有较优的促进作用，且在0.2 mg/L时，对茎的高度、根长和根分化量的促进效果均优于其他浓度水平；培养基为3 g/L花宝1号+2 g/L蛋白胨时，对茎、根以及叶长均有较优的促进作用，B5培养基仅在对叶分化量方面促进作用较优；有机添加物为10%的马铃薯提取液时，对茎、根、叶的促进作用最优。综合考虑各因素对原球茎分化的茎、根、叶的整体影响，最优方案可确定为0.2 mg/L NAA+3 g/L花宝1号+2 g/L蛋白胨+10%马铃薯提取液+20 g/L蔗糖，pH 5.6。

［1］管艳红，马洁，张丽霞.西双版纳石斛属药用植物资源［J］.中国野生植物资源，2004，23（6）：38-39.

［2］LUAN V Q，THIEN N Q，KHIEM D，et al.In vitro germination capacity and Plant Recovery of Some Native and Rare Orchids［C］//Proceedings of International workshop on biotechnology in agriculture.Nong Lam University Ho Chi Minh City，Vietnam，2006：175-177.

［3］SHARMA A，TANDON P.In vitro culture of Dendrobium Wardianum：MorpHogenetic effects of some nitrogenous adjuvats［J］.Indian Journal Plant Physiol.，1992，35（1）：80-85.

［4］SHARMA A，TANDON P，ANJANI K.Regeneration of Dendrobium wardianum Warner（Orchidaceae）from Synthetic Seeds［J］.Indian Journal of Experimental Biology，1992，30：747-748.

［5］卓孝康，兰思仁，彭东辉，等.大苞鞘石斛胚组织培养及植株再生研究［J］.福建林学院学报，2014，34（4）：289-296.

［6］吴元玲，申晓辉.大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存技术的研究［J］.中国细胞生物学学报，2011，33（3）：279-287.

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［8］曾宋君，程式君，张京丽.五种石斛兰的胚培养及其快速繁殖研究［J］，园艺学报，1998，25（1）：75-80.

［9］常俊，丁小余，保曙琳，等.喇叭唇石斛组织培养的研究［J］.中国中药杂志，2004，29（4）：313-317.

［10］查学强.濒危名贵药用霍山石斛类原球茎液体培养生产活性多糖的研究［D］.合肥：合肥工业大学，2006.

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（责任编辑：闫其涛）

Influence of different factors on the protocorm differentiation of Dendrobium wardianum

WANG Wei1，XU Shuang-shuang1，GAO Ai-ling1，QUAN Wei1，LU Shan1*，JIN He-xian2
（1Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325006，China；2Zhejiang A＆F University，Lin’an 311300，China）

Four factors such as 6-BA，NAA，different culture medium and organic additives with 4 levels were selected to study the effects of different factors on the protocorm differentiation of Dendrobium wardianum by orthogonal test.The results showed that the protocorm obtained by sterile culture for 50 d inoculated in the differentiation medium of Hyponex No.1 3 g/L+peptone 2 g/L+NAA 0.2 mg/L+potato extract 10%+sugar 20 g/L（pH5.6）for 70 d could get the best differentiation effect.6-BA had the most significant effect on the differentiation of protocorm.

Dendrobium wardianum；Tissue culture；Protocorm differentiation；Orthogonal test

S567.2

A

1000-3924（2016）06-043-05

2015-11-16

浙江省教育厅高校国内访问工程师校企合作项目（FG2014199）

王伟（1981—），男，硕士，讲师，主要从事园林植物栽培与育种工作

卢珊（1983—），女，硕士，助理研究员，主要从事植物栽培、教学管理研究等工作