孙哲 赵聪颖 郭力

JAK/STAT通路及其抑制剂在多发性硬化和EAE动物模型中的作用

孙哲 赵聪颖 郭力

多发性硬化是中枢神经系统常见的免疫炎性脱髓鞘疾病，其发病机制涉及多条细胞信号传导通路的异常，其中细胞信号传导通路主要包括激酶/信号转导及转录激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)、核因子-κB(NF-κB)、ERK1/2、p38MAPK通路等。本文主要就JAK/STAT信号通路和以此通路作为靶点的药物研究进展做一综述，为多发性硬化的治疗提供新的思路。

多发性硬化；脑脊髓炎，实验性，自身免疫性；JAK/STAT；JAK/STAT抑制剂

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经系统(central nervous system，CNS)白质脱髓鞘为主要病理特点的慢性炎性自身免疫性疾病。目前公认小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)为研究MS的动物模型。在MS/EAE中被激活的免疫细胞产生大量的炎性细胞因子进入血-脑脊液屏障，破坏神经元和少突胶质细胞，这些炎性细胞因子包括白细胞介素12(interleukin-12，IL-12)、IL-6、IL-17、IL-21、IL-23等[1]。近年研究发现，激酶/信号转导及转录激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路调节这些细胞因子的生物学活性，为调控免疫应答所必需。在MS/EAE中，由于大量细胞因子的产生、负向调节因子——细胞因子信号抑制物(suppressors of cytokine signaling proteins，SOCS)的缺失，以及JAK/STAT基因编码产物的富集，致使JAK/STAT通路被异常激活[2]。研究JAK/STAT通路的免疫学机制及相关抑制剂对MS/EAE及其他自身免疫性疾病的作用机制，对MS的治疗将起到启示性作用。

1 JAK/STAT通路在MS/EAE发病机制中的作用

JAK/STAT通路为一种细胞内信号转导通路，JAKs是STATs信号转导通路上游激酶，当其活化后诱导胞浆中单体STATs分子磷酸化，形成STATs二聚体，并转移到核内与DNA相连，进而调节转录过程。JAK/STAT通路对生物活动的控制包括多种机制：通过磷酸酶调节JAK和STAT的磷酸化水平，或者通过SOCS调节JAK激酶的活动。在真核细胞中，此通路与免疫，细胞生长、存活和分化有关[3]。

1.1 JAK/STAT通路 在MS发病机制中的作用固有免疫系统和适应性免疫系统分泌的细胞因子形成错综复杂的免疫网络。固有免疫系统产生的IL-12、IL-23 和IL-27，适应性免疫系统产生的IL-2、IL-17、干扰素γ(gamma interferon，IFN-γ)以及睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF-1)、抑瘤素M(oncostatin-M，OSM)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)共同作用于STAT通路。JAK/STAT通路调控以上细胞因子的生物学活动，为调控免疫应答所必需。

在MS中JAK/STAT通路被异常激活。大量STAT的靶基因，如IL-23R、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6、IFN-γ 、维甲酸相关孤儿素受体γt(retinoid acid related orphan receptor γt，RORγt)、T-bet等在MS中过量表达，并在疾病的发病机制中起重要作用。

JAK/STAT通路不仅调控致炎因子的生物学活动，还影响CD4+初始T细胞的分化方向。在MS复杂的免疫网络中，抗原呈递初始性免疫细胞产生一种细胞因子环境，这一环境影响初始性T细胞的分化方向和免疫应答的性质，导致初始性T细胞向辅助性T细胞家族(helper T cells，Th)1、Th2、Th17 和调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)不同方向的分化[4]。

Th1细胞特征性分泌IFN-γ和IL-2等致炎因子。Th2的细胞分化是由于对IL-4产生免疫应答，并且可以分泌IL-4，与免疫调节有关，缓解炎性反应。故认为Th1/Th2的平衡影响着MS的病程。大量文献表明，这一分化方向的不同与JAK/STAT通路的调节有关。向Th1细胞家族分化依赖于IL-12激活的JAK2/STAT-1和STAT-4机制，诱导其表达IFN-γ和T-bet，加重病情。向Th2的分化依赖于IL-4激活的JAK1/3- STAT6通路，诱导Th2表达IL-4、IL-5、IL-13，缓解病情，另一方面也可抑制Th1相关的细胞因子和信号通路[5]。

初始性CD4+T细胞还可分化为Th17细胞，Th17细胞在MS中也有举足轻重的作用，其分泌的IL-17在MS的发病机制中起重要作用。通过研究发现，MS患者IL-17 mRNA在血液和脑脊髓组织中非常丰富[6]。Th17亚型是一类特殊的辅助型T细胞家族，有一种特殊的转录程序，由IL-6和转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β1诱导，分别依赖STAT3和SMAD信号转导。淋巴结及周围炎性组织中的IL-6连续刺激Treg/Th17的原始细胞，激活STAT3通路，诱导IL-21的表达。随后，IL-21与其受体连接，启动IL-21/STAT3自分泌环路从而维持STAT3的持续性激活，诱导RORγt表达，以及激活Th17表达特征性细胞因子：IL-17A、IL-17F和IL-22。RORγt和RORα是控制Th17细胞进一步分化为炎性反应因子IL-17 的关键转录因子，并可以通过STAT3依赖性机制诱导IL-23受体的表达，从而使正在分化的细胞可以对IL-23产生免疫反应。

1.2 JAK/STAT通路在EAE中的发病作用 大量研究发现，EAE模型中JAK/STAT通路激活，尤其是STAT1、STAT3和STAT4。研究者通过应用STAT蛋白靶基因敲除小鼠研究了不同STAT蛋白家族成员在EAE发病过程中所起的作用[2]。Th1/Th2和Th17/Treg的平衡对EAE的发病有着重要影响，JAK/STAT影响EAE小鼠体内初始CD4+T细胞分化的机制与MS相同。STAT6基因缺陷小鼠表现为Th2生成细胞因子减少，IL-4诱导的B细胞增殖减少以及IgE减少。另外，STAT4在Th1免疫应答过程中发挥重要作用。IL-12与IL-12受体结合后STAT4被激活，诱导IFN-γ表达。STAT4缺陷小鼠缺少IL-12诱导的IFN-γ表达，Th1分化减少，并且表现为Th2占主导的表型。Chitnis等[7]研究发现，STAT6基因缺陷小鼠发病较野生型小鼠严重，尽管其IFN-γ表达量低于野生型小鼠；该研究进一步对STAT4和STAT6基因敲除小鼠细胞因子表达的分析显示，Th1/Th2的平衡是决定疾病临床类型和病理类型的关键因素。

综上，由于初始CD4+T细胞向Th17分化的过程依赖STAT3，STAT3基因敲除小鼠EAE症状减轻。STAT3可调节转录因子RORγt和IL-23R的表达，为Th17细胞分化所必须。因此，STAT3敲除的小鼠不能分化Th17细胞，从而对EAE小鼠起到保护性作用；另外，这些小鼠的Th17细胞中整合素α4/β1及α4/β7表达缺陷，从而阻碍Th17细胞向CNS的迁移[8]。

2 JAK/STAT通路SOCS蛋白家族在MS/EAE发病机制中的作用

除炎性细胞因子过度表达可激活JAK/STAT通路外，负向调控因子的缺失也是造成该通路过度激活的重要原因。正常情况下，STAT转录保守，突变的可能性很小，STAT的高度激活是由于过量的细胞因子表达和负向调节因子SOCS蛋白家族的失调。SOCS家族包括细胞因子诱导的含SH2区域蛋白(cytokine-inducible SH2 containing protein,CIS)和SOCS1-7共8名成员，限制细胞因子诱导信号通路的激活时间[9]。SOCS蛋白表达由细胞因子所诱导，生成一个负反馈环路从而防止细胞因子诱导的JAK/STAT通路过度激活。SOCS的SH2结构域通过与被激活的JAKs和相应的细胞因子受体结合，抑制通路后续的信号转导。SOCS1和SOCS3在SOCS蛋白家族中十分特殊，因为它们包含一个12个氨基酸构成的激酶抑制区杀伤细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor, KIR)，这一区域可作为JAKs的假性底物，抑制JAK激酶的活性。SOCS1和SOCS3在抑制固有和适应性免疫中有着重要的作用，这一作用是通过抑制IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-23和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)所诱导的STAT活化而实现。以上这些细胞因子均涉及MS/EAE的发病机制[9-10]。

2.1 SOCS1及SOCS3在MS发病机制中的作用 很多体外研究结果显示SOCS1在CNS中发挥重要作用。星形胶质细胞中的SOCS1介导的JAK/STAT负反馈信号环路可以限制脑内细胞因子诱导的免疫细胞迁移[11]。在MS中IFN-γ在发病进程中起重要作用，而SOCS1可减少IFN-γ导致的脱髓鞘损伤程度。Kakhki等[12]发现在复发缓解型MS患者体内SOCS1过量表达。SOCS1 对JAK2-STAT3 通路具有负反馈调节作用，可以特异性抑制p-STAT3 的生成，SOCS1 含量随疾病的加重而升高，表明其对机体具有保护性调节作用，可在一定程度上减轻炎性反应损伤[13]。

另一蛋白家族成员SOCS3在MS的发病机制中亦起重要作用。复发缓解型MS患者在复发时SOCS3的表达量低于缓解期。此外，复发期的患者体内STAT3活跃，表明MS的复发与SOCS3表达降低、STAT3激活增高有关。由此推测，SOCS3可能是STAT3的调节因子，调节MS中的炎性应答。他汀类药物不仅可以减少体内胆固醇的合成，而且其还有免疫调节和抗炎作用。有证据表明，辛伐他汀可诱导复发缓解型MS患者体内单核细胞表达SOCS3，从而降低STAT1和STAT3的激活程度，减少IL-6和IL-23等炎性因子的表达，其中IL-6和IL-23可驱使初始性CD4+T细胞向Th17的分化[14]。

2.2 SOCS1及SOCS3在EAE发病机制中的作用 SOCS1和SOCS3在调节初始免疫和适应性免疫过程中起重要作用。在发病初期及高峰期EAE小鼠巨噬细胞中均可检测到SOCS1和SOCS3。

SOCS1的功能为通过与IFN-α受体1和 IFN-γ 受体亚基结合来抑制IFN信号通路，限制IFN激活的STATs(包括STAT1、STAT2 和STAT3)。SOCS1基因敲除小鼠由于对IFN-γ的高反应性，最终发展为多器官衰竭且于出生后3周内死亡[15]。另外SOCS1缺乏小鼠体内的巨噬细胞、树突细胞(dendritic cells, DCs)对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和其他Toll样受体配体高度敏感，导致体内大量促炎因子的产生，包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)、IL-6、IL-12 和 IFN-γ[16]。在EAE小鼠发病初期，由于负反馈作用，少突胶质细胞大量表达SOCS1，保护其免于IFN-γ的损伤，但随疾病的进展，SOCS1受到抑制，EAE病情加重[17]。有学者推测，SOCS1的表达是促进复发-缓解型EAE小鼠缓解的关键[18]。多项研究表明，应用SOCS1拟态，即酪氨酸激酶抑制肽段(Tkip)可预防EAE。Tkip与JAK2磷酸化位点结合，从而抑制JAK2调节的STAT1和STAT3的磷酸化，并且在功能上阻断STAT1调控的IFN-γ和TNF-α信号通路，也可阻断STAT3调控的IL-6信号通路。Tkip的保护作用与其减少CNS中 IL-2、IL-5、TNF-α和 IFN-γ的表达有关。

除SOCS1外，SOCS3在EAE中也发挥了重要作用。与注入正常DCs相比，向EAE小鼠注入表达SOCS3的DCs可缓解EAE的临床严重程度[18]。体外实验结果显示，向小鼠脾细胞注入过表达SOCS3的DCs可减少IFN-γ 和 IL-17 的表达，增加IL-4的表达。由此可见，SOCS3有限制T细胞向Th1和Th17分化的能力，同时可促进其向Th2分化，对EAE形成保护作用。SOCS3可抑制STAT3的激活，T细胞表达SOCS3所导致的结果与STAT3敲除的结果类似。相反，缺乏SOCS3的T细胞由于STAT3的高度磷酸化及IL-17A和IL-17F的高表达，导致其有向Th17细胞亚型分化的倾向。

综上，STAT活性的精确调控对CNS中的免疫应答有调节作用。JAK/STAT信号通路是多种细胞因子的调控信号，由于SOCS蛋白对该通路有抑制作用，在多种CNS疾病的治疗中起到重要作用。值得注意的是SOCS1和SOCS3除可抑制JAK/STAT通路外，还可调控MAPK和NF-κB通路。所以针对此两种蛋白的深入研究可能会为人们理解和治疗CNS疾病有很大帮助。

3 JAK/STAT通路抑制剂对MS/EAE的缓解作用及机制

除可以通过自身产生的SOCS蛋白抑制JAK/STAT通路外，还有一些化学分子及药物也对该通路有抑制作用。

STAT抑制剂，尤其是STAT3和STAT5抑制剂引起了学者的广泛兴趣，一些特定的JAK/STAT抑制剂已经被用于MS的临床前期药物研究，结果显示这些药物对疾病病程，固有免疫及适应性免疫应答均有正面作用。Walker等[19]研究发现STAT3和STAT5的激活与大量癌症疾病和自身免疫性疾病有关，而其抑制剂可发挥治疗作用。STAT转录因子可作为具有高治疗指数的治疗靶点。尽管STATs缺乏酶活性，但它们包含有功能明确的结构域，这些结构域可作为治疗的靶点。关于抑制此通路的策略包括：(1)合成磷酸肽拟态前体药物，以STAT蛋白的SH2结构域为靶点，阻止STATs形成二聚体[20]。(2)以STATs蛋白的N端结构域作为靶点；(3)应用圈套寡核苷酸与激活的STATs连接，从而干扰其与DAN的结合和转录过程[21]。

目前，很多STAT3抑制剂已经成功应用于临床前期的观察。在神经炎性疾病中，一种STAT3抑制剂(ORLL-NIH001)被用于实验性自身免疫性葡萄膜炎，即人后葡萄膜炎的动物模型，结果显示，ORLL-NIH001可缓解疾病的严重性，抑制炎性反应，减少进入视网膜的T细胞的数量[22]。另一种JAK1/JAK2抑制剂AZD1480，被应用于EAE小鼠，拥有显著的疗效。体外培养研究结果显示，AZD1480可通过抑制STAT1和STAT4的活性从而抑制初始性T细胞向Th1细胞分化，降低IFN-γ和T-bet的表达。AZD1480还可通过抑制STAT3的活性以及STAT3下游基因如IL-17A、RORγt、IL-22和IL-23R，从而抑制初始性T细胞向Th17的分化。另外，AZD1480还可通过抑制STAT1、STAT3和STAT5的活性而影响巨噬细胞和DCs的生物学活动[23]。

格拉默(GA)对EAE的保护作用也部分取决于抑制T细胞中STAT3的磷酸化，抑制RORγt的表达，减少Th17的分化[24]。很多中草药成分，包括白花丹素、黄连素和槲皮黄酮，均可通过抑制STAT激活对EAE起保护性作用[25-26]。另外一些其他的药物，如他汀类、醋酸格拉替雷、拉喹莫德等缓解MS的机制也与JAK/STAT相关。他汀类由于具有免疫调节作用及抗炎作用被重点研究：辛伐他汀可直接靶向定位于MS患者的DCs细胞，诱导其表达SOCS1和SOCS3，减少STAT1和STAT3的活性，反过来减少IL-1、IL-23和TGF-β的表达，为Th1和Th17的分化提供一个抑制性细胞因子环境[27]。

综上所述，不同的JAK和STAT蛋白的组合可以诱导不同的基因表达，细胞因子通过激活JAK/STAT通路对调控T细胞的分化和功能起到重要作用。过度激活的JAK/STAT通路对机体有极大的破坏性，可导致包含MS在内的多种自身免疫性疾病。对该通路抑制剂的研究也可以为MS的治疗提供新的方向。

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(本文编辑：时秋宽)

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