郭晓萍，周旖旎，曹诣斌

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

HIF-1反义核酸对金鱼HIF-1α及其靶基因VEGF表达水平的影响

郭晓萍，周旖旎，曹诣斌

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

金鱼是低氧耐受能力最强的淡水鱼类之一，低氧诱导因子-1（hypoxiainducedfactor，HIF-1）在动物低氧应答调节中发挥关键作用，目前尚没有关于鱼类HIF-1抑制剂的研究报道。试验分析了HIF-1反义寡聚核苷酸对金鱼肝脏组织HIF-1及其靶基因血管内皮生长因子（vascularendothelial growthfactor，VEGF）的基因表达差异。荧光定量PCR结果显示，低氧状态下，30，60mg/kg剂量的反义核酸能有效抑制VEGF基因的表达，但对HIF-1α mRNA水平没有影响。制备金鱼HIF-1兔源多克隆抗体并进行WesternBlot分析，结果显示，60 mg/kg剂量的反义核酸抑制低氧所诱导的HIF-1蛋白水平的上升，表明合成的反义核酸能够特异性地抑制金鱼HIF-1 mRNA的翻译。金鱼HIF-1抗体的合成及反义寡聚核苷酸的制备，可为进一步探索金鱼独特的低氧应答机制提供有效研究手段。

HIF-1；反义核酸；低氧；金鱼

低氧诱导因子1（Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是低氧信号调控的重要转录因子，由一个α亚基和一个β亚基组成[1]。HIF-1的氧敏感调控主要发生在HIF-1α亚基。常氧状态下，HIF-1α在相关功能域的作用下降解。低氧条件下，降解途径被中断，HIF-1α的稳定性提高并积累。激活后的HIF-1在其他转录因子的共同作用下，与靶基因的低氧应答元件相结合并调控其表达，如葡萄糖代谢途径的己糖激酶（HK）和乳酸脱氢酶（LDH），血管生成相关的血管内皮生长因子（Vascular endothelial growthfactor，VEGF）等[2]。VEGF是血管生成的主要调节因子，特异性地作用于血管内皮细胞，促进细胞的有丝分裂，使毛细血管的通透性增加。目前研究发现，肿瘤的生长、浸润和转移都与新生血管形成有关[3]。

人们对HIF-1小分子抑制剂进行了多方面的研发，如影响HIF-1α蛋白合成和降解、HIF-1α和HIF-1β二聚化作用、HIF-1α和DNA的结合等[4]。但是，目前还未获得成功上市的特异性HIF-1抑制剂。反义寡聚脱氧核酸（antisense oligonucleotide，反义DNA）是一种短序列单链DNA片段，它与目标mRNA的一个或多个位点互补，从而减少或抑制由该基因所编码多肽的合成[5]。反义DNA可以在mRNA的剪接、转录和翻译水平抑制基因的表达[6]。反义DNA特异性较强，作用迅速，具有局部抑制特性和可逆性，在试验动物模型建立中比较经济、方便且毒副作用较低[7-8]。

金鱼（Carassius auratus）作为鲫鱼的变种，是低氧耐受能力最强的淡水鱼类之一，可能是迄今唯一一种能在室内不依赖气泵而长期生存的鱼类。金鱼拥有一系列独特的低氧适应生理机制，但相关机制的分子调控机理及其与HIF-1之间的关系尚不明确。本研究拟通过金鱼HIF-1反义寡聚核苷酸抑制剂和多克隆抗体的制备，为金鱼耐低氧分子机制的研究提供有效分析方法。

1 材料和方法

1.1 材料

金鱼体质量10～15 g，购于金华市花鸟市场。实验室鱼缸中驯化4～5 d，以商品化鱼食喂养，驯化养殖期间均活动正常，无病，试验前1 d停止投饵。

1.2 试验药物与条件

根据金鱼HIF-1α序列，硫代反义寡聚核苷酸序列为AAAGCCTCAAGTGTCCCAT[9]，由赛百胜公司合成。注射前用鱼类生理盐水（A液：1mol/L NaCl，0.03 mol/L KCl，0.01 mol/L MgSO4·7H2O，0.1 mol/L KH2PO4；B液：0.025 mol/L CaCl2；C液：0.25 mol/L NaHCO3。使用时，每100mL蒸馏水中各加入10mL A液、B液和C液）将反义核酸稀释，常氧生理盐水组与低氧生理盐水组各注射200 μL生理盐水，试验组分别注射30，60 mg/kg剂量的反义寡聚核苷酸。药物注射后常氧状态下培养12 h。

1.3 低氧处理

选择身体健康、反应灵敏、大小基本一致的金鱼，随机取鱼分组，分为常氧生理盐水组、低氧生理盐水组、低氧反义核酸组，每组4只。试剂注射前，统一以1.5 g/L的MS222水溶液进行麻醉处理。待轻触其头部反应迟钝时，迅速抓取，采用腹腔注射法，分别给对照组注射生理盐水溶液，试验组注射反义核酸溶液。注射完成后，将鱼体放回正常生长的自来水中，使其自行苏醒。12 h后，试验组进行低氧处理。在低氧处理过程中，持续充入氮气使氧浓度水平保持为2 mg/L，采用溶氧仪（DISSOLVED OXYGEN METER AZ8403）检测氧含量。在低氧处理6 h后，取出鱼体，于MS222水溶液中麻醉后，解剖提取肝脏组织并迅速放入液氮后，转入-80℃冰箱保存备用。

1.4 Real Time PCR

将肝脏组织从-80℃超低温冰箱取出，用Trizol法提取肝组织样品的总RNA，进行RT-PCR。参照TOYOBO公司ReverTra AceqPCR RT Kit说明操作，将总RNA反转录成cDNA，用于Real Time PCR（RT-PCR）。

Real Time PCR用 Thunderbird SYBRRqPCR Mix试剂盒（Toyobo）和ABI Stepone plus荧光定量PCR仪进行qPCR分析，检测HIF-1α及其靶基因VEGF基因表达水平差异。扩增反应总体系为20μL，其中包括：SYBR GREENⅡ，10 μL；cDNA，2 μL；引物F/R，各0.4 μL；ROX，0.4 μL；ddH2O，6.8 μL。反应条件：98℃，10min；98℃，30 s；55℃，45 s。40个循环后，进行溶解曲线反应，条件98℃，30 s；55℃，45 s。采用ΔΔCt法分析数据。

1.5 Western Blot检测

以金鱼 HIF-1α 759～774位氨基酸序列（CHLLQGEELLRALDQVN）合成多肽作为抗原，免疫兔子4次10周。分离血清，间接ELISA检测抗体效价达到1∶60 000以上，特异性多肽亲和纯化，Western Blot检测抗体特异性。

从-80℃超低温冰箱取出金鱼肝脏组织，放入加有300μL RIPA与5 μL PMSF的EP管内，用组织细胞破碎仪破碎3次，每次10 s，至液体澄清，再向EP管内加入200 μL RIPA，12 000×g，4℃，离心10min。取上清30 μL，加入7.5μL 5×SDS上样缓冲液，99℃，10 min变性。变性后的样品进行Western Blot检测。12%SDSPAGE电泳，转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭90 min，4℃一抗孵育过夜，37℃孵育辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔2 h，最后以ECL显色法（碧云天，特超敏ECL化学发光试剂盒）进行显色成像（Tanon6600成像仪）。

1.6 统计学分析

试验重复4次，数据采用Excel软件统计和做图，组间差异采用t检验进行比较。

2 结果与分析

2.1 HIF-1α及其靶基因VEGF荧光定量PCR

30 mg/kg（图1-A）和60 mg/kg剂量（图1-C）的反义寡聚核苷酸处理，HIF-1α mRNA水平常氧对照组和低氧处理组相比均无显著差异，表明反义DNA基本不影响金鱼HIF-1α mRNA水平。作为HIF-1α的靶基因，VEGF mRNA水平在低氧诱导下显著上升，而30 mg/kg（图1-B）和60 mg/kg剂量（图1-D）的反义寡聚核苷酸处理均显著抑制低氧对VEGF的诱导表达作用。

2.2 金鱼 HIF-1多克隆抗体 ELISA检测与Western Blot鉴定

采用间接ELISA方法检测效价，结果显示，经过4次免疫兔子后，获得的血清和纯化抗体效价分别达到1∶60 000和1∶20 000（图2-A）。Western Blot检测金鱼肝脏样本在约120 kD处出现目的条带（图2-B）。

2.3 反义寡聚核苷酸处理抑制金鱼肝脏HIF-1的蛋白水平

Real Time PCR的结果显示，在基因水平30，60mg/kg剂量的反义DNA基本不影响金鱼HIF-1α mRNA水平，因此，挑取高剂量处理组在蛋白水平分析反义DNA对HIF-1蛋白表达的影响。从图3可以看出，与常氧处理组相比，金鱼肝脏HIF-1蛋白水平在低氧处理6 h后升高；而反义核酸药物处理使低氧组金鱼肝脏HIF-1蛋白水平与常氧处理组无显著差异，表明所合成的反义DNA可以通过阻碍HIF-1α mRNA的翻译，抑制金鱼HIF-1蛋白的表达。

3 讨论

改善实体肿瘤中的低氧微环境是目前肿瘤治疗的一个方向，针对HIF-1小分子抑制剂的研发是其中的重点[10]。对于HIF-1具有抑制作用的小分子化合物已有多种，且大多都是通过级联反应间接影响HIF-1[11]。目前已报道的HIF-1小分子抑制剂在抑制HIF-1的表达、稳定性、翻译活性或核内运输等过程的同时，往往还具有其他已知或未知的生理生化效应，对研究结果的分析造成一定困难。本研究首次将HIF-1反义核酸抑制剂应用于硬骨鱼类，发现所合成的反义核酸能有效抑制金鱼HIF-1 mRNA的翻译及其靶基因VEGF的表达，表明HIF-1反义核酸抑制剂可在金鱼低氧应答分子机制研究中发挥作用。

本研究采用金鱼HIF-1α 759～774位合成多肽作为抗原制备多克隆抗体，Western Blot检测在约120 kD处出现目的条带（而不是根据其氨基酸序列预测的90 kD），这与哺乳动物HIF-1 Western Blot检测结果一致[12]，可能和HIF-1α的翻译后修饰有关。作为鲤形目鱼类第一个HIF-1多克隆抗体，金鱼HIF-1抗体的制备有助于硬骨鱼类特别是鲤科鱼类HIF-1蛋白水平的表达调控分析。

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Effect of HIF-1 Antisense Oligonucleotide Inhibitor on the Expression Level of HIF-1α and Its Target Gene VEGF in Goldfish

GUOXiaoping，ZHOU Yini，CAOYibin
（CollegeofChemistryandLifeSciences，ZhejiangNormal University，Jinhua321004，China）

Goldfish may be the most hypoxia-tolerant freshwater fish in teleost,and hypoxia induced factor（HIF-1）is a master regulator of oxygen homeostasis in animals.Until now,there is still noreport on the HIF-1 inhibitor in teleost.This study analyzed the effectofHIF-1antisenseoligonucleotideinhibitorontheexpressionofHIF-1α anditstargetgeneVEGF inlivertissuesofgoldfish.Real timePCR showedthatantisenseoligonucleotideatadoseof30mg/kgand60mg/kgcouldbotheffectivelydown-regulatethemRNA level of VEGF.However,treatment with antisense oligonucleotide had no detectable effect on HIF-1α mRNA levels under hypoxia.A polyclonal antibody for goldfish HIF-1 was produced and implied in Western Blot analysis.Antisense oligonucleotide at a dose of 60 mg/kg inhibited the hypoxia-induced up-regulation of HIF-1 protein levels in liver tissues of goldfish,which suggested that the antisense oligonucleotide inhibitor could specially repress the translation of HIF-1α mRNA.The production of HIF-1 antibody and antisenseoligonucleotideinhibitorcouldofferauseful waytoinvestigatethemolecularmechanismofhypoxiatoleranceingoldfish.

HIF-1;antisensenucleic acid;hypoxia;goldfish

S965.811

A

1002-2481（2016）07-0914-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.06

2016-02-26

国家自然科学基金项目（31371209）

郭晓萍（1989-），女，安徽宿州人，在读硕士，研究方向：生物化学与分子生物学。周旖旎为共同第一作者。曹诣斌为通信作者。