王有昆, 刘 萍, 李吉涛, 李 健



脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长的克隆和表达分析

王有昆1, 3, 刘 萍1, 2, 李吉涛1, 2, 李 健1, 2

(1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东青岛 266071; 2.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东青岛 266071; 3.上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306)

本研究利用本实验室构建的脊尾白虾()血细胞cDNA文库中的C-型凝集素基因EST序列, 采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end, RACE)技术克隆获得脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长, 命名为。该基因全长1285 bp, 包含1041 bp的开放阅读框, 编码346个氨基酸组成的蛋白质, 分子量为38.56 kDa, 为甘露糖型凝集素。同源性分析表明, 脊尾白虾基因氨基酸序列与秀丽白虾()的同源性最高, 达到91％。荧光定量PCR分析结果表明,基因在血细胞、肝胰腺、肌肉等组织中均有表达, 其中在肝胰腺当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌()和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)后6~12 h, 脊尾白虾血细胞和肝胰腺中的表达量较对照组均显著增加(<0.05), 且具有明显的时间差异性。本研究证明脊尾白虾C-型凝集素在其免疫反应中起到重要作用, 为进一步探索脊尾白虾免疫系统打下基础。

脊尾白虾(); C-型凝集素; 基因克隆; 基因表达

凝集素是具有凝集血细胞作用的一类蛋白。根据其结构特征及特异性结合基序不同, 动物凝集素被分为: L-型凝集素、P-型凝集素、C-型凝集素、I-型凝集素、R-型凝集素、半乳糖结合凝集素(Galectin)和钙连蛋白(Calnexin)。在机体对病害的免疫防御过程中, 凝集素具有识别、黏附, 调理, 促吞噬等生理生化功能[1-3], 在无脊椎动物的免疫系统中更是起到极其重要的作用。C-型凝集素因其钙离子依赖性得名, 在Ca2+存在下能特异地识别并结合外源微生物表面的糖类物质, 引起一系列免疫反应从而有效地抵抗病原微生物的入侵, 例如三疣梭子蟹(、凡纳滨对虾()重组C-型凝集素可与病原微生物结合并凝集甚至阻断感染[4-5]。有研究表明, C-型凝集素还在某些重要的免疫过程如细胞的迁移、细胞间相互作用等过程中起到了至关重要的作用[6-7]。这些研究都证明了C-型凝集素在免疫防御过程中扮演重要角色, 是免疫防御的重要基因之一[8]。

脊尾白虾()是中国重要的底栖虾类[9], 具有繁殖能力强、生长季节长、环境适应性广的特点[10-11], 是中国重要的经济养殖品种。但随着沿海滩涂的开发, 养殖面积的扩大, 病害问题日益严重, 给养殖户造成了严重的经济损失[12]。脊尾白虾作为甲壳动物具有先天性免疫防御功能, 深入研究其免疫相关基因及其作用机制, 可为其养殖病害防治提供理论依据。目前, C-型凝集素基因在中国对虾()[13-14]、斑节对虾()[15-16]、凡纳滨对虾[15-16]等虾类中已见相关报道。且在免疫调节中发挥了重要作用。但脊尾白虾C-型凝集素基因的相关研究则尚未见报道。

本研究利用RACE技术从脊尾白虾中成功克隆了C-型凝集素基因cDNA全长, 通过鳗弧菌()以及白斑综合症病毒感染实验分析了该基因在病原感染后72 h内血细胞和肝胰腺中的表达量变化, 为探讨脊尾白虾C-型凝集素基因在脊尾白虾受病原的刺激下发挥免疫功能的途径和抗病机理, 同时也为脊尾白虾的抗病品系的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用健康脊尾白虾购买于昌邑市海丰水产养殖有限责任公司, 体长(4.13±0.27)cm, 体质量(1.15±0.28)g。每30尾脊尾白虾一组, 于200 L PVC桶中暂养一周。养殖水温(24±1)℃, 盐度25, pH 8.0, 每日换水1/3, 投喂配合饲料。

SMART™RACE Amplification Kit和Advantage 2 PCR Kit购买于Clontech公司; TRIzol Reagent购买于Invitrogen公司; DNA胶回收试剂盒购买于生工生物工程(上海)股份有限公司; 大肠杆菌()Top 10感受态细胞和PMD18-T载体均购买于北京天根生化科技有限公司; SYBR®™Ⅱ(2×)购买于宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 脊尾白虾基因全长cDNA的克隆

根据本实验室前期获得的脊尾白虾C-型凝集素基因的EST序列设计3′RACE和5′RACE特异性引物, 并送由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用SMART™RACE Amplification Kit和Advantage 2 PCR Kit进行3′和5′RACE扩增。将引物CTLF1(表1)和通用引物UPM配对, 进行3′端扩增; 引物CTLR1(表1)和通用引物UPM配对, 进行5'端扩增。反应程序如下: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 72℃ 3 min, 5个循环; 94℃ 30 s, 70℃ 30 s, 72℃ 3 min, 5个循环; 94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 3 min, 25个循环; 72℃ 10 min。

表1 实验所用引物名称及序列

3′RACE和5′RACE扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 使用DNA胶回收试剂盒回收纯化目的片段, 纯化产物连接PMD18-T Vector后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞; 将经菌落PCR鉴定的阳性克隆菌液送往上海桑尼生物科技有限公司进行测序。

1.3 序列分析

利用VecScreen (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/vecscreen/)去除载体序列, 然后用DNAStar软件进行序列拼接、开放阅读框(ORF)的预测和氨基酸翻译。使用BLAST(http: //www.blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)对获得的基因序列进行同源性比对。使用ExPASy(http: //www.expasy.org/tools/)进行蛋白质功能结构域分析、理化性质预测及信号肽序列分析。使用DNAMAN软件对脊尾白虾EcCTL与其他物种的CTL氨基酸序列进行多序列比对, 采用MEGA 4.0软件构建NJ系统进化树。

1.4基因组织表达分析

根据脊尾白虾基因cDNA全长和内参基因18S rRNA的全长序列, 分别设计一对正反引物(CTLF2/R2及18S F/R)(表1), 利用Real-time PCR检测鳗弧菌和WSSV感染后的脊尾白虾血细胞和肝胰腺中不同时间点基因的相对表达量。反应体系和程序参考SYBR®™Ⅱ说明书, 采用20 μL反应体系, 包括10 μL SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(2×), 0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×)*3, 0.8 μL 10 μmol/L引物CTLF2, 0.8 μL 10 μmol/L引物CTLR2, 6.0 μL DEPC水, 2.0 μL cDNA。反应程序为: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40个循环; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 95℃ 15 s。基因的相对表达量通过2–DDCT法计算得到, 使用SPSS 17.0软件对结果进行显著性分析。

1.5 鳗弧菌和WSSV感染实验

实验前用白斑病毒综合症检测试剂盒对随机挑取的10尾脊尾白虾进行检测, 证实其均未感染WSSV。暂养一周后将健康脊尾白虾每50尾一组随机分为3组: 鳗弧菌感染组、WSSV感染组和对照组。鳗弧菌感染组每尾虾注射20μL鳗弧菌菌悬液, 实验用鳗弧菌为本实验室保存, 于实验前一天进行菌种活化, 以磷酸缓冲液(PBS)稀释至终浓度为2×108cfu/mL; WSSV感染组每尾虾注射20 μL WSSV粗提液, 方法参照段亚飞[10], 对照组每尾虾注射20 μL PBS, 注射部位均为第二腹节基部。于注射后0、3、6、12、24、48及72 h每组分别随机取6尾虾的血细胞和肝胰腺, 用于RNA提取。另取6尾健康脊尾白虾的卵巢、眼柄、胃、肠、血细胞、肝胰腺、肌肉和鳃, 分别提取RNA, 检测脊尾白虾基因在不同组织中的表达水平。

2 结果

2.1基因cDNA全长的克隆及序列分析

经紫外分光光度计和1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,脊尾白虾血细胞提取获得的总RNA OD260/OD280为1.88, 18S和28S rRNA条带清晰且完整, 表明所提取的总RNA质量和纯度较高, 能够满足后续实验的要求。分别用特异性引物CTLF1和CTLR1与通用引物UPM配对进行RACE扩增, 获得939 bp和1106 bp的PCR产物。将PCR扩增产物分别测序, 测序结果与已有的EST序列拼接, 获得脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长序列(GenBank登录号为KF791035)并将其命名为。

该基因全长1285bp, 包含1041bp的开放阅读框, 62bp的5′端非编码区(UTR)以及182bp的3′端非编码区, 编码一个由346个氨基酸残基组成的蛋白质, 分子量为38.56 kDa, 理论等电点为4.29, 其N端含有17个氨基酸组成的信号肽。生物信息学分析表明, 脊尾白虾EcCTL氨基酸序列中含有2个糖识别结构域(CRD), 分别在47~179、206~340位置, 并且具有12个保守的半胱氨酸(cys)位点, 参与到糖识别结构域的形成, 12个保守的cys位点分别位于47、58、76、154、170、178、206、217、235、315、331、339位置上。EcCTL的CRD中决定糖结合特异性的基序是“EPD”(Glu306-Pro307-Asp308), 能够结合甘露糖及甘露糖的衍生物。

细实线框标注的ATG是起始密码子, 粗实线框标注的AATAAA代表加尾信号; 粗单线下划线代表信号肽; 细下划线代表糖识别结构域; *表示终止密码子

The start codon (ATG) is marked with thick box, and tail signal (AATAAA) is marked with thick box the signal peptide sequence is marked with a thick line, the carbohydrate recognition domain is marked with a thin underline, and thestop codon is marked with an*

2.2基因的相似性及系统进化分析

对脊尾白虾基因编码的氨基酸序列使用BLAST进行同源性分析, 发现脊尾白虾EcCTL氨基酸序列与秀丽白虾()的同源性最高, 为91%。与其它节肢动物如罗氏沼虾()、墨吉对虾()、日本对虾()、中国对虾、凡纳滨对虾的C-型凝集素的同源性较低分别为37%、37%、36%、36%和36%。将脊尾白虾EcCTL与中国对虾、墨吉对虾、罗氏沼虾、秀丽白虾等动物的C-型凝集素氨基酸序列进行比对发现, 脊尾白虾EcCTL糖结合特异性相关的基序为EPD, 推测其为甘露糖型凝集素(图2)。利用MEGA 4.0软件进行系统进化分析表明, 脊尾白虾EcCTL与秀丽白虾C-型凝集素紧密聚为一支, 之后与中国对虾、墨吉对虾、斑节对虾、凡纳滨对虾等节肢类C-型凝集素聚为一支(图3)。

用▲标注参与CRD分子内二硫键形成的cys, 用下划线标出与C-型凝集素糖结合特异性相关的基序。各物种C-型凝集素序列登录号为中国对虾(ACJ06429)、墨吉对虾(AGS42194)、凡纳滨对虾(ABI97374)、日本对虾(AGW27416)、罗氏沼虾(AFN20600)、短沟对虾()(ABI97372)、秀丽白虾(AGZ95688)

Conserved cysteine residues are marked with a ▲, and the conserved amino acid residues specific to binding by mannose are underlined. The GenBank accession numbers of C-type lectin are as follows:(ACJ06429),(AGS42194),(ABI97374),(AGW27416),(AFN20600),(ABI97372), and(AGZ95688)

2.3基因的组织表达分析

利用Real-time PCR分析了脊尾白虾基因在不同组织中的表达情况, 发现基因在多种组织均有表达。其中, 在肝胰腺中的表达量最高, 胃、卵巢次之, 在肌肉, 眼柄中的表达量最少(图4)。

注射鳗弧菌和WSSV后不同时间点脊尾白虾血细胞中基因的表达情况使用Real-time PCR检测。结果表明: 鳗弧菌感染组和WSSV感染组基因表达量都是大于对照组的。注射后0~12 h鳗弧菌感染组和WSSV感染组基因表达量都是上升的, 12 h时表达量达到峰值且均显著高于对照组(<0.05), 12 h后表达量开始下降, 72 h到达最低值,且表达量仍然高于对照组(<0.05)(图5)。在0~12 h 鳗弧菌感染组基因表达量均高于WSSV感染组, 而24~72 h WSSV感染组基因表达量均高于鳗弧菌感染组。

脊尾白虾C-型凝集素蛋白用▲标注。各物种C-型凝集素序列登录号为斑节对虾(ABI97373)、秀丽白虾(AGZ95688)、拟穴青蟹()(AEO92001)、墨吉对虾(AGS42194)、中国对虾(ACJ06429)、中华绒螯蟹()(BAM17746)、凡纳滨对虾(ABI97374)、短沟对虾(ABI97372)、日本对虾(AGW27416)、赤点石斑鱼()(ACJ12598)、栉孔扇贝() (ACJ12598)、文昌鱼()(ABY54815)、鸡()(NP_001026644)、小鼠()(CAC82936)、人()(AAG00514)

is marked with a ▲.The GenBank accession numbers of C-type lectin are as follows:(ABI97373),(AGZ95688),(AEO92001),(AGS42194),(ACJ06429),( BAM17746),(ABI97374),(ABI97372),(AGW27416),(ACJ12598),(ACJ12598),(ABY54815),(NP_001026644),(CAC82936) and(AAG00514)

脊尾白虾感染鳗弧菌和WSSV后, 肝胰腺中基因的表达情况如图6所示。结果表明: 鳗弧菌感染组基因表达量于注射后0~6 h上升, 于6 h达到最高值, 且其表达量显著高于对照组(<0.05); 然后于6~48 h表达量保持下降趋势, 并于48 h到达最低值; 随后于72 h表达量略有回升, 表达量与对照组相比差异不显著。而WSSV感染组也保持了相似的变化趋势(图6)。

3 讨论与小结

无脊椎动物机体缺乏抗体介导的获得性免疫,C-型凝集素作为先天免疫反应中模式识别受体, 可以在钙离子存在的条件下识别并结合外源微生物表面糖类物质, 引起一系列免疫反应, 达到抵抗病原微生物侵害机体的目的[4]。本研究克隆得到脊尾白虾C-型凝集素基因序列, 同其他物种的C-型凝集基因一样也存在糖识别结构域(CRD), 目前已报道的虾蟹类C-型凝集素都有糖识别结构域的存在, 如斑节对虾PmAV[15]、凡纳滨对虾Lvlc2[17]、中国对虾Fclec1[13]中都含有1个CRD, 而斑节对虾Pmlt[16]、凡纳滨对虾LvLT[18]、中国对虾Fclectin[14]中含有2个CRD。本研究获得的脊尾白虾EcCTL含有2个串联的CRD结构。根据结构和糖结合活性的不同, C-型凝集素可大致分为甘露糖结合型和半乳糖结合型两大类。半乳糖结合型凝集素对应的糖结合位点是保守的“QPD”, 可以结合半乳糖和半乳糖衍生物, 而甘露糖结合型凝集素的结合位点是“EPN”, 在低等的无脊椎动物中“EPN”常常被“EPD”、“EPS”替代, 结合甘露糖与甘露糖的衍生物。凡纳滨对虾LvLT有两个结合位点, 分别是“QPD”和“EPD”而凡纳滨对虾Lvlc2结合位点是“EPS”[17], 本研究获得的脊尾白虾EcCTL糖结合位点正是“EPD”, 推测其为甘露糖型凝集素。

*.同一时间点, 与对照组相比, 组间差异显著(0.05), 下同

Compared with the control group, significant differences (0.05) over the same observation period are marked with an asterisk, the same as in the following

系统进化树分析发现, 脊尾白虾先与同属白虾属的秀丽白虾聚为一支, 再与其他虾蟹类聚在一起, 以上结果证明该序列为脊尾白虾C-型凝集素基因。搜索NCBI得知中国对虾中已经发现7种C-型凝集素(AAX63905.1、ABA54612.1、 ACJ06429.1、ACJ06431.1、ACJ06432.1、ACJ06428.1、ACJ06430.1), 凡纳滨对虾中也有多种C-型凝集素的发现[17-18], 而本研究仅发现脊尾白虾C-型凝集素的一种基因类型, 因此是否存在其他类型还有待进一步研究。

脊尾白虾基因表达具有组织特异性, 在多种组织中均有表达。其中, 在肝胰腺中的表达量最高, 这与中国对虾、凡纳滨对虾当中的研究结果一致[5, 18], 说明肝胰腺是脊尾白虾基因存储释放的主要器官。

三疣梭子蟹重组C-型凝集素对革兰氏阴性菌大肠杆菌有明显凝集作用[6], 凡纳滨对虾感染溶壁微球菌)和WSSV后C-型凝集素Lvlectin1表达量明显上升[19]。凡纳滨对虾重组LVCTL1可以与WSSV囊膜蛋白结合, 阻断WSSV感染[5]。因此C-型凝集素可能在脊尾白虾对细菌和病毒的防御过程中起到了重要作用。为了研究C-型凝集素在脊尾白虾非特异性免疫中的作用, 本研究分别使用鳗弧菌和WSSV对脊尾白虾进行了细菌和病毒感染实验, 通过实验发现在细菌和病毒感染后的脊尾白虾血细胞和肝胰腺中的表达均有明显时间差异性。注射鳗弧菌和WSSV后, 血细胞当中的基因表达量在12 h达到峰值, 与对照组差异显著(<0.05), 这与中国对虾中的研究结果一致[20]。感染后12~48 h,表达量下降, 逐渐恢复到正常水平, 这与中国对虾注射WSSV后表达量变化趋势一致[20]。注射鳗弧菌和WSSV后, 肝胰腺当中的基因表达量在6 h达到峰值, 与对照组差异显著, 然后呈下降趋势, 回到正常水平。凡纳滨对虾注射WSSV后肝胰腺也在6 h达到峰值, 随后下降[17], 这一现象可能是参与识别鳗弧菌和WSSV过程的表现。

为了研究脊尾白虾的生物学功能及其在免疫反应中的作用, 本研究成功克隆获得了脊尾白虾基因cDNA序列全长, 初步探究了该基因在脊尾白虾受到鳗弧菌和WSSV感染后血细胞和肝胰腺中的表达变化, 证明其确实参与了脊尾白虾的免疫应答, 结果将为脊尾白虾免疫机制研究和病害防治提供理论依据。

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Cloning and expression analysis of C-type lectin gene of

WANG You-kun1, 3, LIU Ping1, 2, LI Ji-tao1, 2, LI Jian1, 2

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Qingdao 266071, China; 2. Function Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Based on a hemocyte cDNA library ofgenerated in our laboratory, the C-type lectin cDNA of(named) was cloned by rapid amplification of cDNA ends.was 1285-bp long, containing an open reading frame of 1041 bp and encoding a mature protein of 346 amino acids, with a molecular mass of 38.56 kDa. Homology analysis revealed that its amino acid sequence was highly conserved, with homologs in other crustaceans. The degree of similarity ofwith cDNA ofwas 91%.expression levels in different tissues were analyzed using quantitative real-time PCR. Its expression was detected in all tested tissues, including hemocytes, gill, hepatopancreas, muscle, ovary, intestine, stomach, and eyestalk, with the highest expression level in the hepatopancreas. After challenge withand white spot syndrome virus,expression was upregulated in the hemocytes and hepatopancreas. Our results imply thatplays an important role in the immune response in prawns and lays a foundation for studies on theimmune system.

; C-type lectin; gene cloning; gene expression

(本文编辑: 谭雪静)

[Modern Agro-industry Technology Research System, No. CARS-47; The Program of Shandong Leading Tolent, No. LNJY2015002; National Natural Science Foundation of China, No. 31472275; Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology , No.2015ASKJ02]

Dec. 31, 2014

S917

A

1000-3096(2016)08-0027-08

10.11759/hykx/20141231001

2014-12-31;

2016-06-01

国家虾产业技术体系 (CARS-47); 山东省泰山产业领军人才工程项目(LNJY2015002); 国家自然科学基金(31472275); 青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目(2015ASKJ02)

王有昆(1989-), 女, 山东青岛人, 硕士研究生, 主要从事甲壳类分子免疫研究,电话: 15020022778, E-mail: wangyoukun1989@ sina.com; 刘萍, 通信作者, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn