■牛东泽 郑明利 左飒飒 江 迪 徐春城

(中国农业大学工学院，北京 100083)

苜蓿(Medicago sativa)富含蛋白质、维生素、矿物质等营养成分，而且适口性好、消化率高，是奶牛日粮中不可或缺的组成部分。近年来，国家高度重视苜蓿产业的发展，2012年中央“一号文件”发起“振兴奶业苜蓿发展行动”，随后，在2015年中央“一号文件”又明确提出：加快发展草牧业，支持青贮玉米和苜蓿等饲草料的种植。目前，苜蓿生产的主要产品是干草，但是由于气候、管理等原因，我国许多地方苜蓿干草的调制过程中都存在雨淋、落叶等损失，一般损失率达30%左右。将新鲜苜蓿进行青贮，不仅可以减少苜蓿的营养损失，最大限度保持苜蓿营养成分，还可以改善苜蓿的适口性，提高消化率，延长供应周期，对苜蓿产业发展具有重要意义。

由于新鲜苜蓿中干物质(DM)和可溶性碳水化合物(WSC)含量较低，缓冲能(BC)较高，采用常规青贮技术很难调制出优质青贮饲料。为了抑制发酵过程中不良微生物的生长繁殖，在生产中常常采用与禾本科牧草混贮、萎蔫和添加剂处理等方式，以调制出发酵品质和适口性更好的青贮饲料。乳酸菌是最常用的青贮添加剂之一，添加乳酸菌后可以改善原料中微生物的组成，提高发酵速度，抑制有害微生物的生长，显著改善发酵品质。然而，接种乳酸菌添加剂并非制备优质青贮饲料的充分条件，Weinberg等认为，较高的DM和WSC含量是乳酸菌接种剂提高青贮发酵品质的必要条件，因此在青贮实践中，乳酸菌添加剂常与蔗糖、糖蜜等富含WSC的物质混合使用。玉米粉，作为一种常规精饲料，具有来源广泛、成本低、易保藏等优点。研究证明，玉米粉与苜蓿、巴纳草(Pennisetum purpureum)等牧草混合青贮，能显著提高牧草的发酵品质。Jones研究认为，多数乳酸菌不能利用谷物中的淀粉，谷物类添加剂对发酵品质的改善，主要是由谷物中约3%～4%的WSC或β-葡聚糖等低聚糖水解引起的。因此，在生产实践中若要达到较好的青贮品质，往往需要较大的添加量。

近年来，一些关于能够分解淀粉的乳酸菌的研究受到人们的重视。Nakamura从牛场废料和玉米的混合发酵物中分离出一株具有分解淀粉能力的乳酸菌新种，并定名为食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)。此后Fitzsimons等进行了食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、嗜淀粉乳杆菌(L.amylophilus)和植物乳杆菌(L.plantarum)的生理特性对比试验，结果表明，L.amylovorus不仅具有与L.plantarum相似的生长特点，而且能分泌在青贮pH值范围内具有最佳活性的淀粉酶，但L.amylophilus分泌的淀粉酶在该条件下活性很低。虽然L.amylovorus具有上述优良特性，但目前对于该菌的报道仅限于小麦青贮和食品副产物的乳酸发酵中，而在苜蓿青贮中的应用，尤其是与淀粉类添加剂混合使用的研究未见报道。

本研究通过向苜蓿中添加玉米粉和具有淀粉分解能力的L.amylovorus，研究不同玉米粉添加量和3株L.amylovorus对苜蓿发酵品质的影响，以及二者混合添加的交互作用，以期为苜蓿的青贮实践提供理论指导和方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 青贮原料

青贮原料来源于北京市农林科学院(北京市昌平区)种植的第3茬苜蓿(中苜1号)，初花期刈割，原料的化学成分及微生物组成如表1所示。

1.1.2 添加剂

乳酸菌：本课题组自优质青贮中分离纯化的3株L.amylovorus，分别为L.amylovorusKM112088(L1)、L.amylovorusKM112091(L2)和L.amylovorusKM112089(L3)。

玉米粉：市售玉米粉，粉碎后过500 μm筛。

表1 苜蓿原料的化学成分和微生物组成

1.2 试验设计

本试验采用析因设计(Factorial design)，选取玉米粉添加量和乳酸菌菌株两个因素，其中玉米粉添加量为：0%、3%、6%、9%(鲜重)；乳酸菌菌株为：对照组(蒸馏水)、L1、L2、L3，共16个处理(4×4)，每个处理 3 个重复，共计48袋，青贮35 d后开封。

1.3 试验方法

1.3.1 青贮饲料的调制

将原料切碎至1～2 cm，分成4等份，每份2 400 g，分别按照试验设计量添加玉米粉，充分混匀后，再平均分成4等份，分别添加106cfu/g的乳酸菌L1、L2、L3和等量的蒸馏水(对照)，混匀后，装入青贮专用真空包装袋中，每袋200 g，抽真空密封，26～32℃条件下室内保存。

1.3.2 样品处理

准确称取10 g原料或青贮饲料，装入灭菌自封袋中，加入90 ml灭菌水，充分震荡、浸提，将提取液用灭菌水进行10倍梯度稀释后进行微生物分析。剩余样品过滤，制得浸提液，测定pH值后，置于-20℃冰箱中，冷冻存放，用于测定有机酸和氨态氮(NH3-N)。另准确称取3份切碎的原料或青贮饲料约150 g(精确到0.01 g)，在65℃条件下，烘干48 h，测定水分含量。样品粉碎后过1 mm筛，用于测定粗蛋白质(CP)、NDF、ADF、WSC等物质含量。

1.3.3 微生物、发酵品质及化学成分分析

乳酸菌采用MRS培养基(Difco，美国)，在厌氧培养箱中，37℃条件下，培养48 h进行计数；酵母菌采用添加酒石酸的马铃薯葡糖琼脂培养基(Nissui，日本)，在28℃条件下培养48 h进行计数；好氧细菌和肠细菌分别采用营养琼脂培养基(Nissui，日本)和BLB培养基(Nissui，日本)在37℃条件下，培养24 h进行计数。pH值用Mettler toledo S20pH测定仪测定；WSC采用蒽酮-硫酸比色法测定；淀粉含量的测定参照Jones的方法，糊化后，用高氯酸(HClO4)水解提取测定；NH3-N采用苯酚-次氯酸钠比色法测定；有机酸含量采用高效液相色谱仪(日本岛津LC-20A型，色谱柱：Shodex KC-811，流动相：3 mmol/l高氯酸溶液，流速：1 ml/min，进样量：5 μl，柱温：50 ℃，检测波长：210 nm)进行测定；DM采用烘干法测定；CP由KDY-9830型凯氏定氮仪测定；NDF、ADF采用范式纤维法，在ANKOM 2000i纤维测定仪中进行测定。

1.4 数据处理

采用Excel对数据进行整理，根据析因设计数据分析原理，采用SPSS 20.0的一般线性模型(GLM)对玉米粉、乳酸菌及二者交互作用进行分析，并用Duncan's方法对处理间平均数进行多重比较(P＜0.05)，选取交互作用显著的指标进行精细比较，并在Sigma-Plot 12.5中作图。

2 结果与分析

2.1 添加玉米粉对苜蓿青贮品质及化学成分的影响

经过35 d青贮后，苜蓿单独青贮的pH值、丁酸和NH3-N含量均较高，而乳酸含量与乳酸和乙酸比例均较低，青贮品质较差(见图1)。单独添加玉米粉后，乳酸含量显著(P＜0.05)升高，pH值、NH3-N含量显著(P＜0.05)降低，青贮品质得到明显改善。根据析因设计的分析原理，将玉米粉添加量作为主效应进行分析(见表2)。结果表明，玉米粉添加对各项发酵指标均有极显著影响(P＜0.001)，随着玉米粉添加量的增加，乙酸含量显著降低(P＜0.05)，乳酸与乙酸显著升高(P＜0.05)，6%和9%玉米粉处理组NH3-N含量显著低于3%玉米粉处理组(P＜0.05)，但不同玉米粉添加量对乳酸、丁酸含量没有显著(P＜0.05)影响。添加玉米粉显著提高了苜蓿青贮中DM、WSC、淀粉的含量(P＜0.05)，且随着添加量的增加而升高（WSC除外）(表3)；相反，CP、NDF、ADF的含量随着添加量增加而显著减少(P＜0.05)。

2.2 添加食淀粉乳杆菌对苜蓿青贮品质及化学成分的影响

图1 玉米粉和食淀粉乳杆菌处理对苜蓿青贮35 d后发酵品质的影响

表2 玉米粉和食淀粉乳杆菌处理对苜蓿青贮35 d后发酵品质的影响

在单独添加L.amylovorus的苜蓿青贮中，L2处理组的pH值、NH3-N的含量分别为4.69、7.99%，显著低于对照组(P＜0.05)，乳酸含量、乳酸和乙比酸例与其它处理组相比无显著差异（P＞0.05）(见图1)；而L1和L3处理组的pH值、乳酸和NH3-N含量与对照组相比，均无明显改善。根据析因设计的分析原理，将不同乳酸菌菌株作为主效应进行分析(见表2)。结果表明，L1、L2处理组，pH值、乙酸、丁酸和NH3-N含量显著低于对照组(P＜0.05)，乳酸含量和乳酸与乙酸比例显著高于对照组(P＜0.05)，其中L2处理组pH值、乳酸、乙酸和氨态氮含量均显著低于L1处理组(P＜0.05)，乳酸与乙酸的比例显著(P＜0.05)高于L1处理组。L3处理组除丁酸含量显著低于对照组(P＜0.05)，NH3-N与对照组相比无显著差异外(P＞0.05)，其他各项发酵指标均显著低于对照组(P＜0.05)。在添加不同乳酸菌后，L2处理组，DM、WSC、NDF、ADF的含量显著(P＜0.05)高于其他乳酸菌处理组(P＜0.05)，淀粉和CP的含量显著低于其他乳酸菌处理组。

表3 玉米粉和食淀粉乳杆菌处理对苜蓿青贮35 d后化学成分的影响

2.3 玉米粉和食淀粉乳酸杆菌对苜蓿青贮发酵品质及化学成分的交互作用

如表2所示，玉米粉和L.amylovorus复合处理对青贮苜蓿的pH值、乳酸含量、乳酸与乙酸比例、NH3-N含量以及淀粉含量等指标均存在显著的交互作用(P＜0.05)。因此在分别对玉米粉添加量和乳酸菌菌株2个主效应进行分析后，本研究又对上述指标进行了精细比较并作图。结果表明，在3%、6%和9%玉米粉添加组中，L1和L2处理组的pH值含量均显著(P＜0.05)低于单独添加玉米粉组和L3处理组(见图1)。在3%玉米粉添加量时，L1、L2处理组乳酸含量显著高于对照组(P＜0.05)，其中L1处理组乳酸含量最高，为8.57%，但是二者乳酸与乙酸比例没有显著差异；L3处理组乳酸含量、乳酸与乙酸比例均显著低于对照组(P＜0.05)。在添加不同玉米粉处理组中，L1、L2处理组乳酸含量和乳酸与乙酸比例，均显著高于其他处理组(P＜0.05)，其中6%玉米粉处理组乳酸含量最高，分别为9.75%和9.37%，9%玉米粉处理组乳酸与乙酸比例最高，分别为13.01和13.24。在所有处理中，玉米粉和L2复合处理组NH3-N含量最低，且9%处理组的氨态氮含量显著低于其它处理组(P＜0.05)。在未添加玉米粉处理组，3株乳酸菌处理后其淀粉含量与对照组相比无显著差异(见图2)(P＞0.05)；在添加3%玉米粉后，L3处理组淀粉含量虽然显著低于对照组(P＜0.05)，但是显著高于 L1、L2处理组(P＜0.05)；在 6%玉米粉添加后，与3%玉米粉处理组不同的是，L1处理组淀粉含量显著高于L2处理组(P＜0.05)；而9%玉米粉处理后，L3处理组淀粉含量与对照组相比没有显著差异(P＜0.05)。

图2 玉米粉和食淀粉乳杆菌处理对苜蓿青贮35 d后淀粉含量的影响

3 讨论

3.1 添加玉米粉对苜蓿青贮品质的影响

本研究中，苜蓿直接青贮的发酵品质较差，添加玉米粉后，其发酵品质得到显著改善，尤其是乳酸含量和乳酸与乙酸比例得到显著提升，这主要是由于玉米粉中含有较高的DM和WSC，添加后对青贮原料的特性有显著的改善作用，而DM和WSC的比例会直接影响青贮的品质和效果。虽然不同玉米粉添加量对苜蓿青贮的pH值、乳酸、丁酸含量的影响不显著，但乙酸和NH3-N含量显著降低，乳酸与乙酸比例显著升高，这与Jones的研究结果类似，这可能是由于较高的玉米粉添加，对DM和WSC含量的提升作用更明显，因此加速了发酵过程，进而有效抑制不良发酵的进行。

3.2 添加食淀粉乳杆菌对苜蓿青贮品质的影响

许多研究表明，向青贮料中添加一定量的优质乳酸菌，不仅可加速发酵过程，还能改变青贮饲料的乳酸菌发酵类型，有效地抑制梭菌等不良微生物的活动，保证青贮饲料的质量和安全。本研究中，L2处理组乳酸与乙酸比值最高，L1的比值次之，而L3处理组乳酸与乙酸比值最低，仅为2.43，其pH值和乙酸含量均显著高于L1、L2处理组（见表2），这表明该组处理中异型乳酸发酵强于其他组，这可能是由于不同菌株之间的乳酸代谢的差异引起的。此外，L3处理组，NH3-N含量显著高于其他乳酸菌处理组，这表明该处理组蛋白质分解较多，青贮质量较差。青贮过程中，蛋白质的分解主要受牧草的种类、pH值、DM和发酵温度的影响，L3处理组乳酸含量显著低于其他处理组，pH值显著高于其他处理组，因此推断其在发酵过程中pH值下降缓慢，导致蛋白大量分解，因此产生较多的NH3-N。

在单纯添加106cfu/g的L.amylovorus组中，仅L2显著降低苜蓿青贮的pH值，而L1和L3处理组与对照组相比没有显著改善，这可能是由于只有在DM和WSC含量足够高的情况下，接种乳酸菌才能显著改善青贮饲料的发酵品质，而新鲜苜蓿中DM和WSC含量均较低，因此乳酸菌接种后没有效果或改善效果有限。虽然所用乳酸菌具备解淀粉能力，但是本研究所用苜蓿中淀粉含量较低，青贮前后，淀粉含量仅有轻微变化，因此对苜蓿发酵品质的改善作用有限。

3.3 添加食淀粉乳杆菌对苜蓿青贮中淀粉含量的影响

Owens等研究表明，在1 d中，苜蓿中淀粉含量随着收割时间的延迟而增加，但其在收割后萎蔫的过程中会被植物组织迅速代谢到1%以下，且在青贮前后变化很小。因此，虽然乳酸菌L2具有优良的发酵性能和分解淀粉的能力，但是单独添加该乳酸菌，并不能充分利用该菌分解淀粉能力的优良特性。

玉米粉和乳酸菌复合处理组的淀粉含量显著低于同水平玉米粉添加组，这可能是发酵过程中淀粉被转化为可溶性糖，被乳酸菌发酵利用，因此复合处理组发酵品质显著优于二者单独处理组。在添加的3株乳酸菌中，L3分解淀粉能力较差，尤其是9%玉米粉添加组，其淀粉含量与对照组相比无显著差异，这可能是由于该处理条件下，DM和WSC含量较高，pH值下降速度快，而该菌分泌的淀粉酶在酸性条件下活力较低，其pH值在密封后迅速失活导致的。在6%和9%玉米粉添加组，L2的淀粉含量均显著低于L1处理组，然而3%玉米粉添加组，L1和L2处理后，其淀粉含量没有显著差异，这可能是由于在该条件下，淀粉含量较少，水解较充分导致的，因此在操作条件较差的情况下青贮时，可适当提高玉米粉的添加量。乳酸菌L1和L2在较低的pH值范围内仍然具有较高的淀粉酶活性，这与Fitzsimons等的研究结果一致，而市售的α-淀粉酶则在青贮pH值范围内活力下降明显，不能很好地在青贮中发挥作用，因此，在苜蓿青贮实践中，可选择能够分泌耐酸淀粉酶的优良L.amylovorus菌株和玉米粉混合使用，来提高苜蓿的青贮品质。

4 结论

苜蓿中DM、WSC和淀粉含量较低，单独青贮和添加L.amylovorus青贮发酵品质均较差，而添加玉米粉，可以显著提高苜蓿的发酵品质，但是玉米粉中的淀粉不能被乳酸菌分解利用。复合添加玉米粉和L.amylovorus后，淀粉可有效被降解利用，对pH值、乳酸、氨态氮等发酵指标有显著的改善作用。此外，L.amylovorus分解淀粉酶的能力和产酸能力，在不同菌株间存在显著差异，本试验所用3株L.amylovorus中L2的作用效果最好，L1次之，添加L3不能显著提高苜蓿的青贮品质。因此，在青贮实践中，可以复合添加L1或L2和3%玉米粉，来改善青贮苜蓿的发酵品质。

（参考文献刊略，需者可函索ndz@cau.edu.cn）