谭建英，刘 涛，陈俊英，黄 楠

(1. 西南交通大学 材料学院材料先进技术教育部重点实验室，成都 610031；2. 江苏淮阴工学院 介入医疗器械重点实验室，江苏 淮安 223003)

载VEGF的肝素-PLL纳米颗粒改性表面对抗凝血性及内皮细胞行为的影响＊

谭建英1，刘 涛2，陈俊英1，黄 楠1

(1. 西南交通大学 材料学院材料先进技术教育部重点实验室，成都 610031；2. 江苏淮阴工学院 介入医疗器械重点实验室，江苏 淮安 223003)

利用生物分子间的相互作用制备载VEGF的肝素-多聚赖氨酸(PLL)纳米颗粒，将该纳米颗粒固定于多巴胺涂覆的316L不锈钢表面，研究其对表面抗凝血性能以及内皮细胞行为的影响。通过阿辛蓝染色和甲苯胺蓝定量肝素的方法对改性表面的理化性质进行表征；用荧光染色法和扫描电镜观察表面血小板的粘附数量及形态；通过APTT检测不同样品表面的凝血时间；通过荧光染色法和CCK-8细胞增殖活性检测对改性表面的内皮细胞生长行为进行评价。结果显示，构建的纳米颗粒成功固定于316L不锈钢表面，改性后的表面具有良好抗凝效果(1 h)，且样品体外浸泡0，5和15 d后，依然保持良好的持续抗凝血性；同时，改性后的样品表面内皮细胞数量、形态、活性等生物学行为保持良好，具有明显促内皮再生的潜能。纳米颗粒引入心血管材料表面为其生物功能化提供了一种可行方法。

血管内皮生长因子；纳米颗粒；抗凝；内皮细胞

0 引 言

经皮冠脉支架介入术(PCI)已经成为治疗冠心病的主要方法，但由于支架材料生物相容性不足以及在治疗过程中引起血管内皮损伤，造成血栓及支架内再狭窄等并发症。虽然药物洗脱支架(DES)的出现降低了50%～70%的早中期支架内再狭窄率[1]，但在药物释放结束后，依然存在着很高的晚期并发症风险[2-4]。为此在血管支架表面进行生物化改性，提高表面血液相容性并促进血管内皮再生，是解决术后并发症发生的有效途径。肝素(Hep)能与抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)相互作用，是临床上最常用的抗凝药物[5]。因此，表面肝素化是提高支架材料表面血液相容性的最常用方法之一[6-7]。除此之外，肝素还可与体内多种蛋白及细胞因子结合，并发挥出特定的生物学功能[8]。Hep与细胞外基质蛋白和血管内皮友好性细胞因子的特异性结合具有促进内皮再生的潜能[9]，此外，游离态的Hep能够阻断由这些信号蛋白介导的细胞内信号应答[10-12]。天然的血管内皮层能够形成无血栓和抑制平滑肌细胞增生的表面[13]。血管内皮细胞生长因子(VEGF)作为一种高度特异性的血管内皮有丝分裂素[14]，可以促进血管内皮细胞生长，并在体内诱导血管新生[15]。而肝素与VEGF特异性结合后能够有效保护其活性，Randall等[16]将肝素与PLL结合，并证实固定VEGF的表面具有高特异性捕获内皮祖细胞的能力。Liu等[17]研究表明，装载VEGF的肝素-PLL纳米颗粒具有促进内皮细胞迁移、增殖以及促进内皮祖细胞增殖的能力。

但是关于纳米颗粒持续抗凝的研究却较少，本文不仅研究了接枝纳米颗粒后材料表面的生物相容性，还重点研究了该体系的持续抗凝效果和对内皮再生的影响。

1 实 验

1.1 材料与试剂

316L不锈钢(SS，Ø10 mm)，丙酮，乙醇，蒸馏水，低分子量肝素(大于等于160 U/mg)，多聚赖氨酸(PLL, MW 150 000～300 000)，多巴胺(DM)，甲苯胺蓝(TBO)，罗丹明123，DAPI，磷酸缓冲液(PBS，pH值为7.4)，VEGF(人源)，DMEM-F12培养基，胎牛血清，0.25%胰酶，0.9%氯化钠注射液，细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK-8)，倒置荧光显微镜，超净工作台，CO2细胞培养箱，高压灭菌锅，电热恒温水浴锅，移液枪，酶标仪，全自动凝血机(Clot-1A，Hospitax)。

1.2 载VEGF纳米颗粒的制备与固定

首先将316L不锈钢打磨、抛光并清洗；然后将样品浸没在2 mg/mL的DM溶液中(溶剂为10 mmol/L Tris buffer溶液，pH值为8.5)，20 ℃下静置反应12 h后，用蒸馏水超声清洗3次并烘干，记为1层DM层；重复上述多巴胺沉积步骤两遍，在不锈钢表面共沉积3层DM层，样品标记为DM；随后将14 mg/mL的肝素溶液与700 ng/mL VEGF溶液等体积混合，37 ℃下静置反应1 h后，将其缓慢滴加到等体积的0.5 mg/mL的PLL溶液中，形成载VEGF的肝素-PLL纳米颗粒；最后将DM样品浸没在纳米颗粒悬液中，37 ℃下振荡反应24 h，样品标记为DM-NPV。未装载VEGF的纳米颗粒作为对照组，标记为DM-NP。

1.3 理化性质表征

用水接触角测试仪(JY-82，China)对样品表面进行亲水性检测；用阿辛蓝染色的方法定性表征材料表面肝素接枝情况；用甲苯胺蓝定量表征材料表面肝素接枝量；用罗丹明染色与CCK-8对样品表面细胞进行形态与数量的检测；用罗丹明染色法与扫描电镜法对样品表面血小板粘附进行形态与数量检测。

1.4 血小板粘附实验

将SS与DM作为实验对照样，取新鲜人血于1 500 r/min离心15 min，取上清液，获得富板浆(PRP)；然后在不同样品表面滴加富板浆50 μL，放恒温水浴锅37 ℃孵育1 h；结束后用PBS清洗3遍，洗去物理粘附的血小板；洗后再用2.5%戊二醛室温固定24 h；最后将固定好的样品洗净吹干，再进行罗丹明染色以及扫描电镜观察。再取新鲜人血于3 000 r/min离心15 min，取上清液，获得贫板浆(PPP)；将样品浸泡于280 μL贫板浆中，37 ℃孵育30 min；将全自动凝血机反应杯放在指定位置，加入一定量的APTT试剂和浓度为0.025 mol/L的CaCl2；孵育结束后，依次从样品中吸取250 μL的PPP于反应杯中，选择PPP为对照，根据仪器提示操作，检测APTT值。

1.5 内皮细胞相容性评价

先将已经培养好的细胞用生理盐水清洗3遍，然后每瓶细胞滴加3～4滴0.25%胰酶，将内皮细胞从培养瓶中消化下来，至细胞呈皱缩状，然后加入培养基(20%FBS)吹打瓶底，并且将细胞悬液吹打均匀；加培养基将细胞悬液稀释成2×104个/mL，然后将800 μL细胞悬液缓慢滴加到样品表面，并放入CO2孵箱，培养1，3和5 d；并于特定时间提前3.5 h，在无菌条件下加入CCK-8(V(CCK-8)∶V(培养基)=1∶9)进行细胞活性检测；然后取出细胞，固定后进行荧光染色；最后于倒置荧光显微镜下观察细胞形态与数量。

2 结果与讨论

2.1 纳米颗粒功能层的构建与表征结果

2.1.1 纳米颗粒功能层的构建

如图1所示，先将VEGF与肝素特异性结合、再与PLL等体积混合制成纳米颗粒，然后将纳米颗粒接枝到沉积DM的不锈钢(SS)表面，即得装载VEGF的Hep-PLL纳米颗粒改性表面。

图1 载VEGF的肝素-多聚赖氨酸(PLL)纳米颗粒功能层构建示意图

2.1.2 纳米颗粒功能层的表征结果

(1) 阿辛蓝染色检测

阿辛蓝与肝素结合可以呈现出蓝绿色，样品表面阿辛蓝染色肝素的结果如图2所示。由图2可见，多巴胺表面平整，在光镜下呈橙黄色，而沉积了纳米颗粒的多巴胺表面出现了明显的蓝绿色颗粒，且均匀分布，颗粒之间无聚集现象，表明装载VEGF的纳米颗粒在材料表面固定成功，且均匀分布于样品表面。

(2) 表面亲水性检测

由图3可看出，SS表面水接触角为(59.8±2.8)°，而DM表面为(61±1.5)°，这是由于DM分子中含有疏水性结构苯环，使沉积多巴胺后表面亲水性无明显改善。接枝纳米颗粒后，样品表面水接触角显著下降，其中DM-NP表面为(41.5±1.5)°，DM-NPV表面为(43.3±5.1)°，这是由于肝素与PLL中具有较多的如—COOH、—NH2等亲水性基团。与DM-NP改性表面相比，载VEGF纳米颗粒改性表面亲水性无显著变化，但是仍然具有较好的亲水性。一般认为样品表面亲水性的增加有利于降低血小板粘附和促进细胞粘附。因此，良好的亲水性为改善表面血液与细胞相容性提供了有利基础。

图3 各样品表面水接触角变化

Fig 3 Water contact angle of different samples surface

(3)甲苯胺蓝(TBO)定量肝素结果

图4为接枝纳米颗粒表面甲苯胺蓝法定量检测肝素的结果。实验以DM作为空白对照，由图4可见，接枝纳米颗粒后，表面肝素暴露密度约为9～10 μg/cm2，且DM-NP组和DM-NPV组之间无明显差异。虽然肝素化表面往往表现出不利于细胞生长的特性，但根据Liu Tao等的研究结果，在一定肝素密度范围内，肝素化表面对内皮细胞的生长增殖行为不会产生显著影响[18]。据此推断，本文中样品表面接枝纳米颗粒后，表面肝素暴露密度不会对内皮细胞的行为产生明显影响。

图4 各样品表面肝素定量结果

Fig 4 Quantitative characterization of heparin binding density on DM，DM-NP and DM-NPV

2.2 血液相容性评价

2.2.1 血小板粘附实验结果

血小板的粘附与激活行为将直接影响到表面血栓的形成。样品表面血小板粘附的SEM图如图5所示。

图5 样品表面血小板粘附的SEM图(培养时间：1 h)

由SEM结果(图5)可看出，SS与DM表面粘附了大量血小板，且血小板有大量伪足伸出，部分血小板甚至出现铺展形态，血小板之间团聚现象明显，这表明表面血液相容性差，在体内有引发血栓形成的风险。而DM-NP和DM-NPV改性的表面血小板数量均明显降低，粘附的血小板呈圆形，几乎无伪足伸出现象和铺展形态，说明表面粘附的血小板未激活。又从图6中APTT检测结果可以看出，PPP、SS及DM样品的APTT值相差不大，均在38 s左右；而DM-NP的凝血时间达到85 s左右，DM-NPV凝血时间达到100 s左右、较DM-NP凝血时间更长，表明接枝纳米颗粒的表面凝血时间得到明显延长，通常在临床上使用肝素时APTT值较对照样延长1.5～2.5倍具有较好的抗凝效果。 因此，由以上结果可以看出经过纳米颗粒改性的表面能够有效抑制血小板粘附与激活、显著延长凝血时间，具有良好的抗凝性。

2.2.2 纳米颗粒对持续性抗凝的影响

为了进一步评价样品表面的持续性抗凝效果，本文选择将纳米颗粒改性的样品与对照样浸入无菌PBS溶液中，在37 ℃恒温条件下，摇床震荡5和15 d后取出，并进行血小板粘附实验，以评价其表面血液相容性的变化。

实验结果如图7所示，浸泡之前，SS与DM表面粘附的血小板数量较多，且大量聚集，而接枝纳米颗粒的DM-NP与DM-NPV表面血小板数量明显减少，没有出现聚集现象。

图6 样品表面APTT检测结果

Fig 6 The result of APTT on different samples surfaces

图7 各样品在PBS中浸泡0，5，15 d后表面血小板粘附情况(培养时间：45 min)

Fig 7 Immunofluorescence staining of adherent platelets on different samples surfaces after immersed in PBS 0，5 and 15 d

从图7可知，浸泡5与15 d后，SS与DM表面均粘附大量血小板，且血小板呈严重聚集状态，血小板被激活，因此抗凝效果仍然很差。但是，表面接枝纳米颗粒的DM-NP与DM-NPV样品表面，粘附的血小板数量明显减少，未出现团聚现象，呈现良好抗凝效果。该结果表明，接枝肝素-PLL纳米颗粒的表面，在PBS中浸泡15 d后仍然具有较好抗凝效果，同时，纳米颗粒装载VEGF后，其持续抗凝效果未受影响。

2.3 细胞相容性评价

2.3.1 接枝纳米颗粒表面对内皮细胞形态的影响

在抑制血小板粘附与激活的基础上，理想的支架材料表面还应具有促进表面内皮化的能力，即促进表面内皮再生。图8为血管内皮细胞在接枝纳米颗粒前后的样品表面种植1，3及5 d后的结果，由图8可见，培养1 d后，内皮细胞在表面铺展良好，CCK-8检测结果也表明各样品表面细胞增殖活性相当；培养3 d后，SS、DM及DM-NPV表面细胞数量都有一定程度的增加，铺展呈现铺路石形态，表现出较好的活性，但是DM-NP表面细胞数量虽有一定程度增加，但是形态较差；培养5 d后，样品表面细胞数量均明显增加，并且DM-NPV表面细胞长成了1层致密的细胞层，而对照样SS与DM表面细胞增值不明显，表明VEGF能够较好地促进内皮细胞增值与铺展。

图8 内皮细胞静态培养1，3，5 d荧光染色结果

2.3.2 接枝纳米颗粒表面对内皮细胞活性的影响

表面接枝纳米颗粒后，能够较好促进细胞铺展(图8)，但细胞活性直接影响内皮细胞的增殖与功能，从而影响内皮再生。本文进一步进行了样品表面内皮细胞增殖活性，如图9所示。在培养1 d时，接枝纳米颗粒的样品表面细胞活性不及SS与DM表面；培养至3 d时，各样品表面细胞活性都得到明显增加，但是DM-NPV表面仍与对照样相差不大；而培养至5 d时，SS与DM表面细胞活性相对3 d无明显差别，但是接枝纳米颗粒的表面细胞活性明显增加，DM-NPV表面细胞活性明显高于DM-NP表面，这表明纳米颗粒对细胞有一定的调控作用，并且VEGF能够较好促进内皮细胞增殖，这与文献报道相符合[19]。

图9 内皮细胞静态培养1，3，5 d后CCK-8细胞活性检测结果

Fig 9 CCK-8 result of adherent ECs on different sample surfaces after 1, 3 d culture

2.4 分析与讨论

肝素作为天然的抗凝剂，已经广泛应用于临床。近几年的研究表明，由于肝素具有能够与蛋白、生长因子特异性结合的基团，使其具有较好抑制平滑肌增生、抗炎以及促进内皮化的效果[20-22]。本文利用肝素与多聚赖氨酸静电结合作用，制成如图1所示的三维载VEGF的Hep-PLL纳米颗粒。利用不锈钢表面多巴胺暴露出来的醌基与纳米颗粒中多聚赖氨酸暴露出来的氨基发生迈克尔加成与西弗碱反应，成功构建出装载VEGF的Hep-PLL纳米颗粒改性层。在前期的研究中表明,在DM-NPV改性表面，肝素与VEGF的释放都得到较好的控制[17]，表明在持续释放一定时间后，接枝纳米颗粒的表面仍会暴露出一定量肝素。因此，在释放5和15 d后，接枝纳米颗粒的表面仍具有较好的抗凝效果，如图7所示。较好的抗凝效果是材料表面内皮化的前提，由图8与9可以看出，相对于SS与DM，固定DM-NP的表面细胞数量明显下降，且细胞呈皱缩，细胞活性较差，这是由于ECs对肝素较敏感，较高的肝素含量使得样品表面电负性增强，不利于细胞的粘附。由于内皮细胞自身增殖能力有限，因此在不存在生长因子VEGF时，细胞的CCK-8细胞活性下降，预示细胞出现了一定程度的凋亡，如图9所示。第3及5 d时，DM-NPV表面细胞活性明显高于DN-NP表面，表明VEGF具有抑制ECs凋亡的作用。虽然与SS和DM表面相比，DM-NPV表面ECs生长并不理想，但是相对于DM-NP表面，具有明显的促内皮再生的功能。

3 结 论

(1) 借助多巴胺，构建的载VEGF的肝素-PLL纳米颗粒成功固定于316L不锈钢表面。

(2) 接枝纳米颗粒的表面不仅具有较好的抗凝效果(1 h)，并且在浸泡一定时间(0，5和15 d)后，样品表面依然保持良好的持续抗凝血性。

(3) 接枝纳米颗粒的表面内皮细胞生物学行为(数量、形态和活性)良好，具促内皮再生能力，为心血管材料表面生物功能化提供了一种新方法。

[1] Martin D M, Boyle F J. Drug-eluting stents for coronary artery disease: a review[J]. Medical Engineering & Physics, 2011, 33(2):148-163.

[2] Joner M, Nakazawa G, Finn A V, et al. Endothelial cell recovery between comparator polymer-based drug-eluting stents[J]. Journal of the American College of Cardiology, 2008, 52(5): 333-342.

[3] Finn A V, Joner M, Nakazawa G, et al. Pathological correlates of late drug-eluting stent thrombosis: strut coverage as a marker of endothelialization[J]. Circulation, 2007, 115(18):2435-2441.

[4] Joner M, Finn A V, Farb A, et al. Pathology of drug-eluting stents in humans: delayed healing and late thrombotic risk[J]. Journal of the American College of Cardiology, 2006, 48(1):193-202.

[5] Rabenstein D L. Heparin and heparan sulfate: structure and function[J]. Nat Prod Rep, 2002, 19:312-331.

[6] Hoshi R A, Lith R V, Jen M C, et al. The blood and vascular cell compatibility of heparin-modified ePTFE vascular grafts[J]. Biomaterials, 2013, 34(1): 30-41

[7] Li G C, Yang P, Qin W, et al. The effect of coimmobilizing heparin and fibronectin on titanium on hemocompatibility and endothelialization[J]. Biomaterials, 2011, 32(21):4691-4703.

[8] Kemp M M, Linhardt R J. Heparin-based nanoparticles[J]. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology, 2010, 2:77-87.

[9] Asa D, Gant T, Oda Y,et al. Evidence for two classes of carbohydrate binding sites on selectins [J]. Glycobiology 1992，2: 395-400.

[10] Li X, Zheng Z, Li X,et al. Unfractionated heparin inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory response through blocking p38 MAPK and NF-κB activation on endothelial cell [J]. Cytokine, 2012, 60(1): 114-121.

[11] Ettelaie C, Fountain D, Collier M E,et al. Low molecular weight heparin downregulates tissue factor expression and activity by modulating growth factor receptor-mediated induction of nuclear factor-κB [J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1812(12): 1591-1600.

[12] Li L, Rui X, Liu T, et al. Effect of heparin-derived oligosaccharide on vascular smooth muscle cell proliferation and the signal transduction mechanisms involved [J]. Cardiovasc Drugs Ther, 2012, 26(6): 479-488.

[13] Verheul H M, Pinedo H M. Possible molecular mechanisms involved in the toxicity of angiogenesis inhibition [J]. Nat Rev Cancer, 2007, 7(6): 475-485.

[14] Ma Y D, Li D H. VEGF research progress in the treatment of cardiovascular disease[J]. Chinese Journal of Gerontology 2011, 31(9):1703-1705.

马跃东，李德华，VEGF在心血管疾病治疗中作用的研究进展[J]. 中国老年学杂志，2011, 31(9):1703-1705.

[15] Lu Xiuzhen, Bi Hongsheng, Cui Yan. Effect of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 on rat vascular endothelial cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research. 2012, 16(2):247-251.

卢秀珍，毕宏生，崔 彦，血管内皮生长因子与促血管生成素1对大鼠血管内皮细胞的作用[J]. 中国组织工程研究,2012, 16(2):247-251.

[16] Smith Jr R J, Koobatian M T, Shahini A,et al. Capture of endothelial cells under flow using immobilized vascular endothelial growth factor[J]. Biomaterials, 2015, 51:303-312.

[17] Liu Yang,Zhang Jiang,Wang Jian,et al. Tailoring of the dopamine coated surface with VEGF loaded heparin/poly-L -lysine particles for anticoagulation and accelerate in situ endothelialization[J]. Journal of Biomedical Materials Research,2014, 103(6):2024-2034.

[18] Liu Tao,Liu Yang,Chen Yuan, et al. Immobilization of heparin/poly-l-lysine nanoparticles on dopamine coated surface to create a heparin density gradient for selective direction of platelet and vascular cell behavior [J]. Acta Biomaterialia, 2014, 10(5):1940-1954.

[19] Morales-Ruiz M, Fulton D, Sowa G, et al. Vascular endothelial growth factor-stimulated actin reorganization and migration of endothelial cells is regulated via the serine/threonine kinase akt [J].Journal of the American Heart Association, 2000,86(8):892-896.

[20] Yang Z, Tu Q, Wang J, et al. The role of heparin binding surfaces in the direction of endothelial and smooth muscle cell fate and re-endothelialization[J]. Biomaterials, 2012,33:6615-6625.

[21] Brown R A, Leung E, Kankaanranta H,et al. Effects of heparin and related drugs on neutrophil function[J]. Pulm Pharmacol Ther, 2012,25:185-192.

[22] Lever R, Smailbegovic A, Page C P. Locally available heparin modulates inflammatory cell recruitment in a manner independent ofanticoagulant activity[J]. Eur J Pharmacol, 2010,630:137-144.

Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031,China;2.Jiangsu Provincial Key Laboratory for Interventional Medical Devices,

Huaiyin Institute of Technology, Huai’an 223003,China)

Thesurface construction by heparin-poly-l-ly-sine (Hep-PLL) nanoparticles loaded VEGF and the influence to anti-coagulation and endothelial regeneration

TAN Jianying1，LIU Tao2，CHEN Junying1，HUANG Nan1

(1.Key Laboratory of Advanced Technology of Materials, Ministry of Education,

The ideal biomaterials surface for the blood or vascular contacting should be hemocompatibility and endothelialization ability. This study focuses on improving the anti-coagulation and endothelial regeneration of 316L stainless steel (316L SS) surface by introduced VEGF-loaded heparin-poly-l-lysine (Hep-PLL) nanoparticles to its surface. The VEGF-loaded nanoparticles (NPV) were firstly constructed by electrostatic interactions. And the NPV were then immobilized on dopamine-coated 316L SS surface. The physicochemical properties of the modified surface were characterized by water contact angle assay, Alcian blue staining and toluidine blue O assay, etc. The adhesion behavior and morphology of platelets on the modified surfaces were evaluated by fluorescence staining and scanning electron microscope (SEM). The clotting time were tested by APTT. The endothelial cell growth behaviors were evaluated by fluorescent staining and Cell Counting Kit-8 (CCK-8). The results revealed that the NPV were successfully immobilized onto 316L SS surface. The introduction of the loaded-VEGF nanoparticles obviously increased the blood compatibility due to the less platelet adhesion compared to the 316L SS surface. The modified surface also provided favorable endothelial regeneration according to the endothelial cells adhesion, proliferation and its biological activity based the CCK-8 measurements. Meanwhile, the modified surface still exhibited exciting antithrombogenic properties after immersed in PBS solutions for 5 and 15 d. Our results indicated that the surface modification of loaded VEGF heparin-poly-l-ly-Sine (Hep-PLL) nanoparticles could be a promising strategy for cardiovascular contacting device.

VEGF; nanoparticles; endothelial cells; anticoagulation

1001-9731(2016)12-12097-07

国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2011CB606204);国家自然科学基金资助项目(31470921,31170916)

2016-04-14

2016-08-30 通讯作者：陈俊英，E-mail: chenjy@263.net

谭建英 (1989-)，女，四川营山人，在读硕士，师承陈俊英教授，从事生物材料表面改性研究。

R54；TH77

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.12.015