赵 晶，何 洁，王金祥，蔡学敏，庞荣清，潘兴华

人脐带间充质干细胞体外规模化、标准化制备技术研究

赵 晶，何 洁，王金祥，蔡学敏，庞荣清，潘兴华

目的建立人脐带间充质干细胞标准化、规模化制备技术。方法在无菌条件下，采集剖腹产婴儿脐带30条，长40～50 cm，弃被膜、血管后，剪成1 mm3的组织块，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12的培养瓶中进行组织块反复贴壁培养，采用倒置相差显微镜动态观察细胞的生长及形态，对传代培养的第3代细胞采用流式细胞分析法进行细胞周期及表形分析，采用体外定向诱导分化实验观察多向分化潜能。结果组织块贴壁后于第4 d开始向周围呈放射状长出细胞，平均12 d左右长满瓶底，细胞形态呈均一梭形；传代培养后生长快速，于4～5 d达80%融合；连续传代3次，其生长特性和形态不变，CD90、CD29阳性率＞99%，CD105阳性率＞81%，不表达CD34，CD45，在体外能分化成骨、软骨、脂肪细胞。平均每条脐带获得细胞数＞6×109个。结论通过多条人脐带重复分离培养，建立了体外规模化、标准化的人脐带间充质干细胞的制备与鉴定技术规范及标准，可为人脐带间充质干细胞库建设和临床应用提供技术支持和标准化脐带间充质干细胞。

脐带；间充质干细胞；制备；鉴定，规模化；标准化

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是一类来源于新生儿脐带组织的具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，具有向神经、血管、肌肉、骨、软骨、脂肪等多种功能细胞分化的潜能[1-6]。该类细胞的特点是[4-5]：（1）来源丰富、取材方便；（2）增殖能力强，易于体外规模化制备，标准化生产和储存；（3）免疫原性低，异体或异种移植无明显免疫排斥反应，临床应用安全性可控；（3）可广泛用于各种损伤、退变、自身免疫反应等疾病治疗；（4）比其他来源的干细胞更具有产业化和临床应用优势。目前，不同实验室的hUC-MSCs制备方法和结果有一定差异，缺乏统一的技术操作标准，从而导致培养出来的细胞质量不尽相同，从而导致实验研究和临床治疗结果有一定差异。本实验室前期已经建立了组织块多次贴壁法高效制备hUC-MSCs的技术，本研究在此基础上，通过重复和优化技术操作，进一步规范了技术操作流程和方法，为建立 hUC-MSCs库，研发hUC-MSCs的临床制剂及转化应用奠定了技术基础。

1 材料与方法

1.1 脐带来源 新生儿脐带采自本地区三甲医院或省级妇幼保健医院，采集前进行围产期孕妇血标本的乙型肝炎病毒DNA、丙型肝炎病毒DNA、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒，支原体检测，均为阴性。同时留样4℃储存2个月后复检，排除潜伏携带病原。产前影像学和遗传代谢性疾病筛查，胎儿发育良好，无先天性畸形。采集脐带长度40～50 cm，采集后立即转送到细胞制备实验室。采集脐带前，均告知产妇，征得家属同意并签署知情同意书。

1.2 主要设备和试剂 DMEM/F12培养液（Hyclone），胎牛血清（FBS）和 0.25%trypsin-ETDA（BI公司），流式细胞仪（FACSCalibur,BD公司），流式抗体（Beckma），成脂、成骨、成软骨诱导试剂盒（GIBCO公司）。

1.3 UC-MSC分离和培养 在无菌条件下，将采集的新鲜剖腹产足月胎儿的脐带放入无菌50 ml的离心管中，于1 h内送至细胞制备实验室。在无菌条件下，用生理盐水反复冲洗，去掉残留血渍、被膜和血管；用含有双抗的PBS液浸泡2～3 min后，将脐带剪碎成1 cm长，然后分装于EP管内，用眼科剪将组织块剪成1 mm3左右，洗涤后再对应移至到175 cm2培养瓶中，加入7～8 ml的10%FBS的DMEM/F12，摇晃后使组织块均匀分布，再将培养瓶放于5% CO2、37℃的培养箱中静置培养，3～4 d换液。观察细胞生长状态，待细胞从组织块周围爬出且生长至80%～90%融合时，用0.25%trypsin-EDTA消化，按1∶3的比例传代培养至第3代，收集细胞，计数存活率后冻存。

1.4 细胞表型分析 采用第3代细胞，用0.9%生理盐水洗涤反复离心3次，分成含1×106个细胞/管，加入 10 μl抗 CD90-FITC、CD105-PE、CD-29FITC、CD34-PE、CD45-PC5，避光孵育30 min，磷酸盐缓冲液洗涤后，用流式细胞仪进行相关表型分析。

1.5 细胞分化潜能检测

1.5.1 成脂诱导分化 取P3生长良好的细胞，按1×104个/cm2接种到12孔板中，放置5%CO2培养箱静置培养，每隔3 d换液一次，至细胞100%融合时，去除上清，用生理盐水换洗2次，加人成脂诱导分化试剂培养，每隔3 d换液一次，培养14～21 d后，采用多聚甲醛固定，油红O染色观察。

1.5.2 成骨诱导 用第3代细胞按5×103/cm2接种到6孔板中，放置5%CO2、37℃、95%湿度培养箱中静置培养，每隔3 d换液一次，至细胞60%融合时，去除上清，用生理盐水换洗2次，加人成骨分化诱导液培养（GIBCO，美国，成骨诱导试剂盒）；每3 d换一次液，培养至第21 d，用4%多聚甲醛固定，茜素红染色5～10 min，在显微镜下观察并拍照。

1.5.3 成软骨诱导分化 利用第3代生长良好的细胞，调整细胞浓度为1×107/ml，吸取5 μl接种到6孔板中，放置5%CO2、37℃、95%湿度培养箱中培养2 h，加入2 ml成软骨诱导培养液，每3 d换液1次；培养第14 d，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，阿新蓝染色，显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 UC-MSCs的生长及形态 组织块贴壁法原带在4～6 d时，可见组织快周围有纤维样细胞呈放射状爬出，呈菱形、星形或多边形等(图1A)；12～15 d可见大量克隆状细胞生长（图1B），细胞生长融合至80%～90%。按1∶3的比例消化传代后，传代4 d可见纤维样细胞长满瓶壁，呈菱形旋窝状，增殖速度快，活性好，形态均一。

图1 体外培养的UC-MSCs

2.2 UC-MSCs的表型 对P3代细胞进行免疫抗原表达检测，结果显示，CD90和CD29表达率＞99%，CD105表达率为80%，CD34表达率低于1%，符合UC-MSCs表型标准。见图2。

图2 第3代hUC-MSCs表型

2.3 UC-MSC的分化潜能 成脂分化：P3细胞成脂诱导分化14～21 d后，可见胞浆内充满脂滴3；成骨分化：P3细胞成骨诱导分化21 d，可见红色的钙质结节3；成软骨分化：P3成软骨诱导分化14～28 d后，可见蓝色的软骨胶原基质3。见图3。

图3 UC-MSC的诱导分化结果

2.4 hUC-MSCs的获得量 本组实验中，经组织块反复3次培养并传代3次，每条脐带获得的第3代脐带间充数量≥6×109个，可满足临床100例次治疗用；若传代到第5代，可满足900例次使用。按此方法继续传代，预计每条脐带可制备出满足上千例次使用的标准化脐带间充质干细胞。

3 讨论

鉴于hUC-MSCs的多向分化潜能和强大的免疫调节功能[6]，预计将在各种损伤、退变、中毒和自身免疫性疾病治疗中发挥重要作用，特别是对放射伤、战创伤修复治疗具有特别重要的军事医学价值。涉及hUC-MSCs的临床应用，首先必须获得足够数量的标准化细胞。本研究组经过多年摸索，建立了一套高效、规模化制备hUC-MSCs的技术方法，在本研究的基础上，完成了治疗多种疾病的疗效与安全性评价及机制研究，并建立了种子细胞库，初步解决了临床前关键技术问题。

与国内外相关报道相比，本研究的结果更具有系统性、重复性和稳定性，可作为体外高效、规模化制备标准化hUC-MSCs的参考方法，也可为建立干细胞库提供技术支撑。本课题参照Bruyn和本研究组前期建立的方法，进一步改进和完善了多次贴壁法高效制备hUC-MSCs的方法，建立了组织块多次贴壁制备hUC-MSCs的方法，获得率更高，结果更稳定、可靠。经过免疫表达和诱导分化检测，均符合间充质干细胞生物学特点和国际细胞学会制订的间充质干细胞评价标准，与国家卫计委和国家食品监督管理局于2015年8月联合发布了《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》的要求一致。

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[2] Wakitani S,Saito T,Caplan AI.Myogenic cells derived from ratbone marrow mesenchymal stem cells exposed to5-azacytidine [J].Muscle Nerve,1995,18(12):1417-1426.

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[4] 何洁，赵晶，王金祥，等.多次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞[J].西南国防医药，2015,25(8):828-831.

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[6] Bruyn CD,Najar M,Raicevic G,et al.A rapid,simple,and reproducible method for the isolation of mesenchymal stemcell cells from Wharton's jelly without enzymatic treatment[J].Stem Cells Dev,2011,20(3):547-557.

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1395-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.012

2016-07-04）

国家科技支撑计划项目（2014BI01B0）；国家973计划项目（2012CB5181060）；云南省科技计划重点项目(2013CA005）

650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省干细胞工程实验室，昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

潘兴华，E-mail:xinghuapan@aliyun.com