何 洁，赵 晶，王金祥，蔡学敏，朱向情，马丽花，庞荣清，潘兴华

大剂量人脐带间充质干细胞制剂给予CD-1小鼠的安全性评价

何 洁，赵 晶，王金祥，蔡学敏，朱向情，马丽花，庞荣清，潘兴华

目的观察单次大剂量输入自制的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)制剂的急性反应，为临床研究提供安全保障。方法60只SPF级CD-1小鼠随机分为阴性对照组、溶剂对照组和制剂组，每组雌雄各半（n=10），制剂组按1×108个细胞/kg的剂量给CD-1小鼠单次静脉注射hUC-MSCs制剂，阴性对照组和溶剂对照组分别输注同等容量的0.9%氯化钠注射液和勃脉力A溶液。输注后连续观察小鼠的临床表现、体重和摄食量。观察15 d后，将动物安乐死，进行大体解剖，观察并行组织病理学分析。结果实验期间，制剂组1只小鼠输注细胞的尾尖静脉处出现细胞堆积，引起局部毛细血管堵塞，从而导致尾尖部组织坏死。其余动物均未见异常表现和体重、食量差异，大体解剖和组织学观察未见明显与输注细胞相关的病理改变。结论hUCMSCs制剂单次静脉注射给予CD-1小鼠无急性毒性反应。

脐带；间充质干细胞；急性毒性实验；CD-1小鼠

人脐带间充质干细胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)来源于脐带的胶状结缔组织，具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控能力[1-3]。动物模型治疗实验和一些临床研究证实，hUC-MSCs对肝损伤、脊髓损伤、退行性病变、移植物抗宿主排斥反应（GVHD）以及自身免疫性疾病等有治疗意义[4-5]。为推进hUC-MSCs的临床转化应用，本课题组按临床生物制剂标准研发出1种“hUC-MSCs注射液”，为保证临床应用的安全性，本实验观察了单次静脉给予较大剂量hUC-MSCs制剂的急性毒性反应。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 hUC-MSCs制剂来源于本院生物治疗中心干细胞库，批号为P20131101，浓度为2× 106个/ml，性状为微黄色细胞悬液，保存条件为液氮保存；含5%人血白蛋白（广东卫伦生物制药有限公司）和10%DMSO（Bioniche Pharma USA LLC）的复方电解质溶液（上海百特医疗用品公司）。

1.2 实验动物 60只SPF级的CD-1(ICR)小鼠，雌雄各半，雌性体重19.4～22.1 g，雄性17.8～22.4 g，同性别动物的体重均在平均体重的20%范围内，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。小鼠饲养于装有垫料的聚丙烯鼠盒中，鼠盒规格为295 mm×195 mm×125 mm，雌雄分养，每盒最多饲养同性别5只动物。动物自由摄食，自由摄水。

1.3 hUC-MSCs制剂制备 阴性对照剂为市售0.9%氯化钠注射液；溶剂对照剂为用勃脉力A配制终浓度含有1%人血白蛋白、2%DMSO和1050 IU/ 10 ml(约1050 IU/4×107细胞)低分子肝素钙的溶液。hUC-MSCs制剂的配制：首先用勃脉力A配制成含有1%人血白蛋白的制剂A溶液。将细胞冻存袋自液氮中取出，迅速置于40℃水浴中，快速融化后，将细胞用适量制剂A稀释，使细胞充分混悬后，用台盼蓝染色，计数细胞活率≥90%。加入约10倍体积的制剂A，离心洗涤细胞3次，用终浓度含1%人血白蛋白、2%DMSO和1050 IU/4×107个细胞的低分子肝素钙的勃脉力A溶液稀释细胞浓度为4× 106个/ml，冰盒保存和运输。配制后4 h内完成输注。

1.4 hUC-MSCs制剂输注方法 输注细胞前1 d，从66只动物中挑选检疫合格、体重相近的60只动物（雌雄各半），用区段随机分组法，按性别分为两个区段，用Excel软件给予每只动物一个随机数，并按照随机数从小到大的排序，将小鼠分为3组，每组雌雄动物各10只。制剂组输注剂量为1×108个细胞/kg、浓度为4×106个细胞/ml，3组输注容量均为25 m l/kg。临床拟用剂量为1×106个细胞/kg体重，制剂组用量相当于临床拟用剂量的100倍。阴性对照组和溶剂对照组分别输注同等容量的0.9%氯化钠注射液和勃脉力A溶液（含1%人血白蛋白、2%DMSO和1050 IU/4×107个细胞的低分子肝素钙）。用1 ml一次性无菌注射器输注，吸取细胞液前轻轻摇晃，经小鼠尾静脉注射，输注细胞速度约为3～4 min/只，单次输注。

1.5 观察指标 输注后笼旁观察，1 h内每15 min观察记录1次，1～4 h内每1 h观察1次。输注第8 d和第15 d观察小鼠的精神状态、行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛门、四肢、足和呼吸等情况。

输注后次日开始，每天上午和下午各1次，笼旁观察动物死亡或濒死情况、精神状态、行为活动、进食情况、粪便性状等，连续观察14 d。

分别在输注前1 d（D1）和输注后的第 8 d（D8）、第15 d（D15），测定动物体重。每周加料1次，第8 d、第15 d称量剩余饲料，据加料量和剩余饲料计算平均每天每只动物食量。食量以±s表示，但不进行统计学分析，根据动物体重和食量的变化趋势以及临床观察结果和病理检查，综合判断制剂的急性毒性反应情况。

1.6 病理学观察 输入细胞15 d后，小鼠经CO2麻醉后，股动脉放血安乐死，进行大体解剖。对所有组织脏器进行原位观察，记录肉眼可见异常，并对异常组织或器官进行组织病理学检查。

1.7 统计学方法 应用SPSS15.00软件对不同组别动物的体重进行统计学分析，雌雄分开，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，假设检验水准为α=0.05，结果分析时同时考虑统计学意义和生物学意义。

2 结果

2.1 临床表现动态观察情况 制剂组1只雄性小鼠于给药后4 min，出现精神不振、俯卧和自主活动减少，于输注次日恢复；输注后22 min注射局部血管呈紫黑色线状，输注次日尾部呈紫黑色，输注后第4 d尾部基本恢复正常，仅尾尖部略呈紫黑色，之后变为黑色；输注后第10 d尾尖部黑色区域脱落，断开部位略呈红色肿胀，持续至观察期结束。除此之外，实验期间，其他动物各时间段均未见异常临床反应。

2.2 体重变化 与同期同性别阴性对照组相比，其他两组的体重均呈正常增长，差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

2.3 食量变化 与同期同性别阴性对照组相比，其他两组的食量未见明显差异（P＞0.05，表2）。

2.4 病理学变化 制剂组出现异常反应的雄性小鼠大体观察可见尾尖部略肿胀，镜下主要表现为尾尖部皮肤表皮细胞肿胀，皮下水肿伴中性粒细胞浸润，局灶皮肤全层坏死结痂，但尾部注射部位血管及其周围组织未见明显异常改变。考虑该病变可能是由于输注局部细胞堆积，引起局部毛细血管堵塞，从而导致尾尖部组织坏死（图1）。除此之外，其他动物大体观察均未见明显异常。

图1 尾部病理组织结构（HE染色，×40）

3 讨论

基于间充质干细胞广泛的应用前景，本研究在前期开发了一种复苏后可直接应用于临床的hUC-MSCs制剂的基础上，进行了hUC-MSCs制剂的急性毒性试验。本研究采用的是高于临床拟使用剂量的100倍静脉回输动物体内，观察其急性毒性反应。在动物选择方面，CD-1小鼠遗传背景清楚，对药物的反应比较稳定，个体差异较小，饲养方便，体形较小，便于实验操作，是毒理学试验中常用的实验动物之一。实验期间，仅有制剂组1只动物因为输注细胞局部堆积引起局部毛细血管堵塞，从而导致尾尖部组织坏死，其余均未出现与输注细胞相关的急性毒性反应。本实验结果表明，单次静脉注射给予CD-1小鼠最大耐受剂量（MTD）≥1×108个细胞/kg，为临床安全使用提供可靠的动物实验依据。

表1 各组不同性别小鼠不同时间体重变化(g）

表2 各组不同性别小鼠不同时间食量变化［g/（只·d）］

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Safety evaluation of hUC-MSCs agent after large dose injection administered to CD-1 mice

He Jie,Zhao Jing,Wang Jinxiang,Cai Xuemin,Zhu Xiangqing,Ma Lihua,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;Yunnan Stem Cell Engineering Laboratory,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Kunming, Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the acute reaction after large dose injection of self-prepared human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs)to provide safety guarantee for clinical research.MethodsA total of 60 SPF-grade CD-1 mice are random ly divided into negative control group,solvent control group and preparation group.The number of each group was equally split between male and female mice (n=10).The CD-1 mice in the preparation group were administrated with hUC-MSCs preparation by single intravenous injection according to 1×108cell/kg.The negative control group and the solvent control group were infused with 0.9%sodium chloride injection and Plasmalyte-A solution with equivalent capacity respectively.The clinical presentation,body weight and food intake of mice were continuously observed after the infusion.After 15 days of observation,euthanasia was conducted on the animals and gross anatomy was carried out for observation and histopathological analysis.ResultsDuring the experiment,one mouse in the preparation group had accumulation of infused cells in the vein at the tail tip,which caused local capillary blockage and necrosis of the tail tip.Other animals had no abnormal reaction and difference in body weight and food intake.No obvious pathological change relevant to infused cells was discovered in Gross anatomy and histological observation.ConclusionThe administration of hUC-MSCs preparation to CD-1 mice by single intravenous injection causes no acute toxic reaction.

UC;MSC;acute toxicity experiment;CD-1 mice

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1362-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.003

2016-06-28)

国家科技支撑计划项目（2014BI01B0）；国家973计划项目（2012CB5181060）；云南省科技计划重点项目(2013CA005）

650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省干细胞工程实验室，昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

潘兴华，E-mail：xinghuapan@aliyun.com;庞荣清,E-mail:pangrq2000@aliyun.com