李 芸 杨梦妍 陈小雪 梁建芬 韩北忠

微生物强化发酵对米粉品质的影响

李 芸 杨梦妍 陈小雪 梁建芬 韩北忠

（中国农业大学食品科学与营养工程学院；食品质量与安全北京实验室，北京 100083）

采用接种植物乳杆菌（L.p-35）、发酵乳杆菌（L.f-7）、热带假丝酵母（C.t-3）、枯草芽孢杆菌（B.s-14）进行强化发酵制作米粉，通过测定发酵后大米及米粉的蛋白、淀粉、直链淀粉含量，采用扫描电镜观察发酵对大米籽粒外观结构的影响，并从米粉产品质构、感官品质2方面研究了强化发酵与传统自然发酵的差别。强化接种L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14（第4组）4种微生物发酵制得的米粉与其他强化发酵组相比，蛋白含量明显降低，淀粉、直链淀粉含量明显增加。通过扫描电镜观察，强化发酵组明显改变了大米颗粒表面结构。结合质构及感官评定，第4组及自然发酵组制得的米粉品质在弹性、咀嚼性、爽滑感等方面优于其他强化发酵组。综合各方面评分，第4组在优化大米结构、提高米粉品质方面存在明显优势，并结合pH、微生物变化情况，强化发酵有利于加速发酵过程。

米粉 强化发酵 乳酸菌 品质

米粉是一类条状、丝状米制品的统称，在中国有着悠久的传统和历史［1］。米粉以早籼稻为主要原料，其生产工艺主要包括浸泡（发酵）、磨浆、蒸坯、挤丝、冷却等［2］。鲜食米粉的生产过程中采用一定时间的自然发酵，发酵程度完全靠经验和生产需要确定，这一方面不能保证每次发酵程度的一致性，从而不能保证产品感官品质的一致性；另外，参与自然发酵的微生物种类非常多，为米粉微生物安全的控制带来一定的难度。

实践证明经过发酵后制成的食品在口感、风味上都有较大的改善［3］。目前米粉的研究多集中在工艺、成分变化、物化性质等方面，在微生物发酵菌种及发酵机理等方面研究较少，缺乏工业化生产的理论指导，使米粉的现代化发展比较缓慢。

前期研究表明，自然发酵过程是在细菌和真菌的共同作用下完成的［4］，在发酵的过程中，微生物的数量和菌相发生了很大的变化，对于米粉的风味和品质起着很重要的作用。经过微生物计数，其中乳酸菌为优势菌，其次为酵母菌和一些芽孢菌。

本研究运用本课题组先前从发酵米粉中分离、筛选得到的优势菌株：植物乳杆菌（L.p-35）、发酵乳杆菌（L.f-7）、热带假丝酵母（C.t-3）和枯草芽孢杆菌（B.s-14）进行强化发酵，通过与自然发酵组生产得到的米粉样品进行对比，研究纯种强化发酵对米粉品质的影响，旨在为米粉纯种工业化生产及品质调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

早籼米：市售；植物乳杆菌（L.p-35）、发酵乳杆菌（L.f-7）、热带假丝酵母（C.t-3）和枯草芽孢杆菌（B.s-14）：本实验室从传统发酵工艺的大米浸泡过程中分离、筛选得到，保藏于-80℃冰箱中；直链淀粉标品、支链淀粉标品：Sigma公司；淀粉酶：江苏锐阳生物科技有限公司；细菌总数测试片、霉菌酵母测试片：美国3M公司；乳酸细菌培养基（MRS）：北京奥博星生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

SCD500喷金仪：Leica公司；JEM-6700F扫描电镜：JEOL 公司；TA.XT plus物性测定仪（TPA）：Stable Micro System公司；SPD50自动凯式定氮仪：三品科创公司；SpectraMax M2e自动酶标仪：Molecular Devices公司。

1.3 试验方法

1.3.1 米粉的制作工艺

根据米粉厂生产实际及成明华［5］的方法，按照工艺制作：原料→浸泡（发酵）→磨浆→蒸坯→挤丝→煮制→冷却→成品。发酵过程为接种微生物强化发酵，共分为4 组，分别接入L.p-35；L.p-35+L.f-7；L.p-35+L.f-7+C.t-3；L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14。各试验组菌悬液初始浓度为106cfu／mL，接入量为1%。对照为自然发酵组，按照传统工艺，不做任何处理，各试验组于25℃恒温培养箱中发酵3 d。

1.3.2 发酵液pH 测定

取各组浸泡过程中的溶液，每24 h取1次，用酸度计进行pH测定。

1.3.3 发酵过程中微生物计数

取各组浸泡过程中的样品25 g，每24 h取1次，放入225 mL无菌生理盐水中，置于漩涡混匀器上，充分混匀，在超净工作台内以10倍稀释法进行梯度稀释。选取2个合适的稀释度，吸取1 mL稀释液于测试片上，细菌总数、真菌总数的检测均按照测试片说明操作；乳酸菌采用MRS培养基倾注培养，于30℃培养48～72 h，恒温培养箱培养后计数。

1.3.4 蛋白质含量测定

蛋白质含量的测定参照GB 50095—2010中的规定进行。

1.3.5 淀粉含量测定

淀粉含量的测定参照GB 5009.9—2008中的规定并做一些改进，分别称取发酵后的大米、成品米粉2～5 g（精确至0.000 1 g），样品采用酶水解法进行测定，还原糖含量采用DNS法进行测定。

1.3.6 直链淀粉含量测定

分别称取（0.010 0±0.000 5）g直链淀粉和支链淀粉标品于烧杯中，加入1 mL无水乙醇使之分散，再加入9 mL的1 mol／mL NaOH溶液，置于沸水浴中煮沸糊化10 min，冷却后定容到50 mL容量瓶中。配制直链淀粉标准溶液，其中乙酸（1 mol／mL）和碘试剂（2%碘化钾和0.2%碘，m／V）的混合液按1∶4（V／V）在临用前混合、摇匀。配制后充分混匀静置20 min，于620 nm处比色并记录吸光度值。以直链淀粉为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作直链淀粉标准曲线。

将浸泡发酵后的大米、成品米粉烘干后粉碎，过60目筛。称取已过筛的样品（0.040 0±0.005 0）g于烧杯中，方法同上，冷却后定容到100 mL容量瓶中。将1.5 mL待测样品与0.5 mL蒸馏水和5 mL乙酸和碘试剂的混合液混匀后静置20 min，于620 nm处比色测定，并记录吸光度值。

1.3.7 微观形貌特性

干燥好的大米样品采用喷金仪进行喷金，之后用扫描电镜观察大米表面微观形貌特性。

1.3.8 质构特性测定

采用质构仪TPA模式测定。质构仪探头选用TA3／100探头，其他参数设置：测前速度1 mm／s，测试速度0.5 mm／s，测后速度0.5 mm／s，测试距离20 mm，触及压力5 g，压缩比50%。质构TPA指标包括硬度形变、弹性、胶着性和咀嚼性等。

1.3.9 感官评价

由6人对不同组米粉成品进行感官评定，评定在样品制成10 min内完成。米粉的感官评定主要从香气、色泽、口感等几个食用指标进行分析。

1.4 数据分析

试验重复测定3次，应用SPSS16.0软件分析，用单因素方差分析ANOVA（one-way analysis of variance），以Duncans多重比较检验（Duncans multiple range tests）。试验结果以均值±标准差表示，P＜0.05时具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 发酵过程pH变化

图1 强化发酵过程中pH变化

米粉发酵过程主要作用微生物为乳酸菌［4］，乳酸菌代谢产生大量的乳酸，使发酵液处于低pH值水平。研究表明，低pH可以抑制一些致病菌，包括大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等［6-7］，使得发酵食品的安全得到保障。对强化发酵及自然发酵组样品浸泡发酵液进行了pH测定，结果见图1。随着发酵的进行，pH值不断下降，在发酵第1天pH下降最为明显，发酵结束时各组pH值均在4.5以下。接种植物乳杆菌L.p-35的发酵液pH高于其他发酵组，这可能是由于强化接种单一乳酸菌在发酵过程中没有其他微生物的协同作用，发酵缓慢。自然发酵组的发酵液pH下降最为平缓，这可能是由于发酵过程中其他微生物的共同作用，包括酵母菌、霉菌等参与发酵过程，在发酵初期乳酸菌不是优势菌株所致。其他3组pH值下降趋势基本一致，在发酵第1天下降最为明显，发酵后期变化不显著，说明乳酸菌在发酵过程初期就成为主导的优势菌，这为强化发酵能缩短米粉发酵过程提供一定的理论依据。并且接种2种乳酸菌的3个发酵组（第2、3、4组）pH明显低于接种单一乳酸菌组（第1组），低于自然发酵组，说明多菌种强化发酵更低的pH值对于抑制致病菌方面也优于自然发酵组。

2.2 发酵过程中微生物量变化

图2 发酵过程中微生物量变化

对强化发酵及自然发酵组发酵液测定了微生物量变化情况，结果见图2。在米粉发酵过程中，乳酸菌是主要优势菌，其次是酵母菌。乳酸菌和酵母菌在发酵过程中存在共生关系。乳酸菌在酵母菌产生乳酸菌所需的维生素和氨基酸等生长物质的同时创造了一个有益于酵母增殖的酸性环境［8］。因此对发酵过程中微生物量的变化情况进行监测，可以判断发酵条件对于米粉品质的影响是否有利。

在发酵过程中，菌落总数、真菌总数、乳酸菌总数都随着发酵时间不断变化，呈现增长的趋势。虽然自然发酵组未强化接种乳酸菌，起始乳酸菌数较低，但不同组乳酸菌在发酵结束均达到相同的数量级，成为优势菌；真菌增长情况可以看出，第3、第4组因强化接种热带假丝酵母（C.t-3）而增长较快，但在发酵结束，除自然发酵组较其他组低一个数量级之外，其他强化发酵各组均达到相同的数量级，这可能是由于自然发酵过程中微生物之间相互抑制，生长过慢；菌落总数各组增长情况基本一致。从结果可以看出，乳酸菌在发酵过程中成为优势菌，达到1011cfu／g。

2.3 强化发酵对蛋白含量的影响

大米中蛋白质质量分数为7%～8%，主要为谷蛋白，其余为白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。大米中的蛋白质多以与直链淀粉结合的形式存在，影响大米粉的理化性质［9］。发酵可显著降低大米中蛋白质的含量。在发酵前期，蛋白质的减少主要是蛋白溶出引起的，而发酵后期，被微生物利用，导致蛋白质的含量显著降低［10］。对强化发酵及自然发酵组样品及制成的成品米粉测定蛋白质含量，结果见表1。

表1 不同发酵条件大米、米粉蛋白质含量

第2～4组浸泡米蛋白质含量显著低于第1、第5组蛋白质含量（P＜0.05）。说明添加2种及以上微生物强化发酵组在发酵过程中对蛋白质作用明显，使得大米中的蛋白质分解，被分解为小分子肽甚至氨基酸而溶出。成品米粉蛋白质含量方面，除了第1组高于其他组之外，其他发酵组无差异性。虽然从营养方面讲，发酵降低了蛋白含量，但是蛋白含量的降低则起到了纯化淀粉、改善淀粉凝胶性能的作用。并且微生物生长离不开碳源、氮源等营养物质，大米中的蛋白是微生物生长所需唯一氮源，因此由于微生物的发酵作用，蛋白含量显著下降［11］。

2.4 强化发酵对淀粉、直链淀粉含量的影响

淀粉是构成米粉凝胶的基础，其性质与米粉的凝胶性质密切相关。直链淀粉糊化后能迅速老化形成凝胶，因此对制作米粉的品质具有决定作用。一般直链淀粉含量越高，米粉质地坚实，越耐煮。淀粉是大米的主要成分，研究发现大米自然发酵后淀粉和直链淀粉含量变化不大，微生物对淀粉的降解作用不明显［12］。Numfor等［13］对发酵木薯粉和淀粉进行了研究，认为发酵过程的酸或酶水解支链淀粉使其形成类似直链淀粉的物质，使直链淀粉含量明显升高。对强化发酵及自然发酵组样品及制成的成品米粉测定淀粉、直链淀粉含量，结果见表2。

图3 不同发酵组大米扫描电镜照片（×500）

表2 不同发酵条件大米、米粉中淀粉、直链淀粉含量／g／100 g

第4、第5组浸泡米、成品米粉中的淀粉含量和直链淀粉含量显著高于其他组（P＜0.05），第4组与第5组相比存在显著差异（P＜0.05）。说明第4组接种L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14 及自然发酵组（第5组）微生物作用对于纯化淀粉，提高淀粉含量改善米粉品质具有积极作用。本结果与闵伟红［14］的研究结果基本一致，其研究表明采用乳酸菌发酵早籼米后直链淀粉含量有所增加。

2.5 发酵对大米颗粒表面微观结构的影响

利用光学显微镜、扫描电子显微镜或偏光显微镜，可以从整体形态、颗粒大小、轮纹特点等方面对大米淀粉的微观形貌进行研究。淀粉是大米中的主要成分，经过发酵后蛋白被分解，淀粉得到纯化。对强化发酵及自然发酵组大米样品进行扫描电镜观察，结果见图3、图4。

图4 不同发酵组大米扫描电镜照片（×2 500）

由图3、图4可见，各发酵组米粒表面结构被破坏严重，淀粉颗粒间出现了一定的孔隙，周围形成了不连续、不规则的基质，结构非常疏松，形成了类似海绵的多孔状结构。而未发酵米表面仍然较平整，未见疏松结构。说明发酵过程中产生的大量代谢产物、乳酸等对于大米表面结构有较大影响。同时可以看出，第3、第4组较第5组大米表面孔洞更多，形成层次错落的结构（×2 500），结合pH变化情况，说明强化发酵加速了发酵过程。

2.6 强化发酵对米粉质构的影响

研究表明发酵后大米淀粉颗粒更加均匀，可形成均匀致密的凝胶，使发酵米粉的凝胶流变学特性发生明显的改变［15］。对强化发酵及自然发酵组制得的米粉样品进行质构特性测定，结果见表3。

表3 强化发酵对米粉质构的影响

第4、5组在硬度、弹性、黏聚性、胶着性、咀嚼性、回复性方面都显著高于第1、2、3组的数值（P＜0.05）。说明第4 组接种L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14及自然发酵组（第5组）多种微生物作用可以提高米粉的硬度和弹性，改善米粉的咀嚼性和回复性。这可能是由于发酵产酸及产酶作用改变了淀粉的分子结构，支链淀粉分子发生断链及脱支，使其水合能力增强，易于糊化，不易老化，利于保持凝胶水分，维持凝胶结构，而发酵使直链淀粉易于聚合和老化，形成较强的凝胶网络［16］。这与直链淀粉含量增加相一致。

2.7 强化发酵对米粉感官品质的影响

感官评定对于评价食品的品质是很好的方法，虽然存在一定的缺陷，包括由评价人员情绪、喜好、品评环境带来的一些不确定因素，但感官评定可以用来弥补仪器在爽滑感、筋道感、细腻感、色泽、气味方面评价的不足。对强化发酵及自然发酵组制得的米粉样品进行感官评价测定，结果见表4。

第4、第5组在硬度、凝聚性、弹性、爽滑感方面显著高于第1、2、3 组的数值（P ＜0.05）；各组在细腻感、色泽、形态方面不存在显著差异（P＞0.05）；自然发酵组（5组）在气味方面与其他组存在显著差异（P＜0.05），评分明显低于其他各组；总评分上，除第1组数据明显低于其他各组存在显著差异，其他各组评分差异不明显。综合各组数值，第4组接种L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14 及自然发酵组（第5组）与第1、2、3组相比，经过多种微生物作用，在提高米粉品质，增加米粉弹性、爽滑感方面存在优势。第4、第5组在气味上存在差异，第5组米粉制品酸味明显，另外在发酵过程中观察发现发酵液产生大量气泡，发酵液浑浊，这可能是腐败微生物繁殖所致，而第4组米粉米香醇厚，发酵过程中无腐败酸臭现象。综合总评分，第4、5组评分最高，但不存在显著差异，说明强化接种L-35+L-7+F-3+B-14发酵制得的米粉，在品质方面与自然发酵米粉不存在差异，而且在控制腐败微生物、影响米粉气味方面存在优势。

3 结论

强化接种L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14微生物发酵的大米，在淀粉纯化、降低蛋白质含量、提高直链淀粉含量等方面优于其他强化发酵组，但与自然发酵还是存在一定差异。经过对制得的米粉进行质构测定、感官评价测定，第4组与自然发酵组之间不存在显著差异，但明显优于其他强化发酵组。综合各方面评分，第4组在优化大米结构、提高米粉品质方面存在明显优势，并结合pH、微生物量变化情况，强化发酵有利于加速发酵过程。因此强化接种L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14 微生物发酵得到的米粉品质良好，为今后开发米粉纯种发酵剂提供了参考。

表4 强化发酵对米粉感官品质的影响

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Effect of Fortified Fermentation with Microorganisms on Quality of Rice Noodles

Li Yun Yang Mengyan Chen Xiaoxue Liang Jianfen Han Beizhong
（Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）

Fermented rice noodles were produced by inoculating Lactobacillus plantarum （L.p-35），Lactobacillus

fermentum （L.f-7），Candida tropicalis（C.t-3），and Bacillus subtilis（B.s-14）.The effect of fortified fermentation with microorganisms and traditional fermentation was compared on protein content，starch content，amylose content，textural properties and sensory quality by observing the effect if fermentation on the appearance structure of rice grain using the scanning electron microscope.The results indicated that compared with other fortified groups，the protein content of group 4 was decreased，and the starch content and amylose content were increased in fortified fermented rice noodles with 4 strains（L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14）.The analyses of scanning electron microscope showed that the structure of rice grain was eroded after fermentation.The textural qualities and sensory of group 4 and the natural fermented group on elasticity，smooth and smell were better than that of the others.Meanwhile the rice texture and rice noodles quality were improved.Fermentation process was promoted after fermentation fortified considering pH and microorganism changes.

rice noodles，fortified fermentation with microorganisms，lactic acid bacteria，quality

TS213.3

A

1003-0174（2016）11-0001-07

863计划（2013AA102105），国家谷子糜子产业技术体系建设专项（CARS-07-12.5-A17）

2015-03-27

李芸，女，1986年出生，博士，食品微生物学

韩北忠，男，1961年出生，教授，食品微生物学及发酵工程