付文娟+常娜+王帅

[摘要] 目的 探讨Livin、Caspase-8在人骨肉瘤组织中的表达及临床意义。 方法 选择2008年3月～2015年3月于唐山市人民医院就诊的骨肉瘤患者64例为观察组，取其骨肉瘤组织作为生物样本；选择同期就诊的非骨肉瘤患者64例为对照组，取其正常骨痂组织作为生物样本。按照骨肉瘤诊治规范对相关生物样本进行分析，分析观察组所有样本的肿瘤位置、肿瘤大小、病理分型、Enncking分期等；检测两组样本中Livin和Caspase-8的表达水平；分析其与肿瘤生物学行为的相关性。 结果 Livin在观察组骨痂组织中阳性表达率显著高于对照组（P < 0.05），Caspase-8在观察组骨痂组织的阳性表达率显著低于对照组（P < 0.05）；性别、年龄、肿瘤位置和病理分型与Livin和Caspase-8的表达水平无关（P > 0.05），而肿瘤的大小、Enncking分期和患者最终生存时间与Livin和Caspase-8的表达相关（P < 0.05或P < 0.01）；Livin蛋白表达和Caspase-8蛋白表达呈负相关（r = -0.392，P < 0.05）。 结论 骨肉瘤组织中Livin的表达量显著升高，而Caspase-8的表达量显著降低，且Livin和Caspase-8的表达与骨肉瘤的肿瘤大小、Enncking分期及患者最终生存时间有关。

[关键词] 骨肉瘤；Livin蛋白；Caspase-8蛋白；临床意义

[中图分类号] R738.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（c）-0033-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of Livin and Caspase-8 in human osteosarcoma. Methods The osteosarcoma cancer tissues of 64 patients with osteosarcoma cancer who were examined and treated in Tangshan Peoples Hospital from March 2008 to March 2015 were collected as the observation group. Another 64 patients with non-osteosarcoma cancer were selected as the control group. The relevant biological samples were analyzed in accordance with the standard of diagnosis and treatment of osteosarcoma cancer. The tumor location， tumor size， pathological type， Enncking stage and so on of the observation group were analyzed and observed. The expression level of Caspase-8 and Livin was detected in the two groups and its correlation with tumor biological behavior was analyzed. Results The positive expression rate of Livin in the observation group was significantly higher than that in the control group （P < 0.05）. The positive expression rate of Caspase-8 in the observation group was significantly lower than that in the control group （P < 0.05）. Sex， age， tumor location and pathological type were independent with the expression levels of Livin and Caspase-8（P > 0.05）， however， tumor size， Enncking stage and the final survival time were correlated with the expression of Caspase-8 and Livin protein （P < 0.05 or P < 0.01）. The expression of Livin protein was negatively correlated with the expression of Caspase-8 protein （r = -0.392， P < 0.05）. Conclusion In osteosarcoma tissue， the expression of Livin is increased significantly and caspase-8 was significantly reduced. The expression level of Livin and Caspase-8 is related to the tumor size， Enncking stage and the final survival time of osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma； Livin protein； Caspase-8 protein； Clinical significance

在我国，骨肉瘤的发病对象主要为青少年儿童，且近年来的发病率有逐年上升的趋势[1]，对社会稳定和青少年生命健康和安全造成了严重的影响[2]。目前，临床对于骨肉瘤的发病机制研究尚不完全清晰，诸多学者认为[3]，细胞正常凋亡受阻可能直接参与了骨肉瘤的发生、发展[4]。Livin是最新发现的人凋亡抑制蛋白家族中的一种蛋白因子，半胱天冬酶（Caspase）则是一类在进化上非常保守的蛋白酶类分子[5]。其中，Caspase-8参与到细胞凋亡过程中[6]。本研究旨在探讨Livin、Caspase-8在人骨肉瘤组织中的表达及临床意义，从而揭示骨肉瘤发病可能的生物学机制，为临床生物分子药物寻找有效靶点提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2008年3月～2015年3月于唐山市人民医院（以下简称“我院”）就诊的骨肉瘤患者64例为观察组，取其骨肉瘤组织作为生物样本，其中男38例，女26例，平均年龄（19.8±2.6）岁。选择同期我院就诊的非骨肉瘤患者64例为对照组，取其正常骨痂组织作为生物样本，其中男38例，女26例；平均（20.2±2.2）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①符合临床诊断标准，其中骨肉瘤诊断符合全国软组织和骨肿瘤病理诊断学术研讨会论文汇编上制定的标准，且经影像学检查和病理组织学检查确诊。②心智健全，有自主判断能力。③术前未接受放化疗等治疗。④知情同意并签署知情同意书。排除标准：患有器质性疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病、精神性疾病，以及无法配合治疗者。

1.3 方法

1.3.1 两组骨痂组织中Livin和Caspase-8的检测方法 本研究中使用工作液浓度为1∶100的Livin鼠抗人单克隆抗体，购于Abcam公司；工作液浓度1∶50的Caspase-8兔抗人多克隆抗体购于ABclonal公司；PBS粉剂和免疫组化MaxVisionTM/AP试剂盒购于杭州艾康生物技术有限公司。采用标准方法制作石蜡切片，即福尔马林固定和石蜡包埋，设定切片厚度为4 μm。采用免疫组化MaxVisionTM/AP法行Livin和Caspase-8检测，按照产品说明书步骤严格执行，阴性对照为PBS代替一抗，对照为对照组受试者的正常骨痂组织切片。

1.3.2 结果判定标准 细胞中可见棕黄色细小颗粒，可认定为阳性染色的Livin蛋白或Caspase-8蛋白。在400倍显微镜下记录每张切片的10个视野，观察每个视野中100个细胞的染色状况。判定标准要根据阳性染色的细胞数目和细胞染色强度进行判定，阳性染色细胞占比的评定标准：阳性染色的细胞占比<10%，记为1分；阳性染色的细胞数目占比为10%～50%，记为2分；阳性染色的细胞占比>50%～75%，记为3分；阳性染色的细胞占比>75%，记为4分。细胞染色强度的评定如下：染色强度为淡黄色，记为1分；染色强度为棕黄色，记为2分；染色强度为棕褐色，记为3分。将阳性染色的细胞数目得分与细胞染色强度得分相乘，得出最终结果。总分≥3分为阳性，总分<3分为阴性。同时分析Livin蛋白表达和Caspase-8蛋白表达之间的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性采用Pearson相关性分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组骨痂组织中Livin、Caspase-8的表达情况

Livin蛋白多在细胞核内呈阳性，极少在细胞浆内呈阳性。Caspase-8蛋白多在细胞浆内呈阳性，极少在细胞核内呈阳性，见图1。观察组骨痂组织中Livin阳性表达率（66.94%）明显高于对照组（10.94%）（P < 0.0），而观察组骨痂组织中Caspase-8的阳性表达率（12.90%）明显低于对照组（90.63%）（P < 0.01）。见表1、2。

2.2 不同病理因素的骨肉瘤组织中两种蛋白的表达差异

性别、年龄、肿瘤位置和病理分型与Livin和Caspase-8的表达水平无关（P > 0.05），而肿瘤的大小、Enncking分期和患者最终生存时间与Livin和Caspase-8的表达相关（P < 0.05或P < 0.01）。其中，Livin在直径≥8 mm的组织切片、ⅡB～Ⅲ期的组织切片和生存时间<5年的患者的组织切片中的表达量更高（P < 0.05），分别为86.21%、88.46%和90.24%；Caspase-8在直径≥8 mm的组织切片、ⅡB～Ⅲ期的组织切片和生存时间<5年的患者的组织切片中的表达量更低（P < 0.05），分别为3.85%、5.71%和4.89%。见表3。

2.3 Caspase-8蛋白和Livin蛋白表达在骨肉瘤组织中的相关性

在64例骨肉瘤患者的组织切片中，Livin和Caspase-8同时呈阳性表达的患者仅有2例，而只有Livin阳性表达的患者为41例，只有Caspase-8阳性表达的患者为6例，余15例患者为阴性表达。相关性分析结果显示，Livin蛋白表达与Caspase-8蛋白呈明显负相关性（r = -0.392，P < 0.05）。见表4。

3 讨论

骨肉瘤是常发于青少年中的一种恶性肿瘤，其恶变程度高，发病初期症状不明显，出现明显症状患者就医时往往已经处于中晚期。对于骨肉瘤的治疗目前临床上仍然以手术和放化疗为主。研究认为[8-9]，骨肉瘤的出现与细胞凋亡系统功能紊乱有关[10-12]。细胞凋亡过程受抑制，导致肿瘤细胞无限增殖和转移。因此，寻找与细胞凋亡系统相关的基因靶点作为未来骨肉瘤的治疗靶点是战胜和治愈骨肉瘤的关键。

结果显示，骨肉瘤组织Livin表达水平明显偏高，且显著高于正常骨痂组织，且Livin的阳性表达还与骨肉瘤的肿瘤大小、Enncking分期及患者最终生存时间有关。在直径较大、Enncking分期处于ⅡB～Ⅲ期和最终生存时间短于5年的患者体内Livin阳性表达率显著升高。进一步研究Caspase-8蛋白后发现，骨肉瘤组织细胞内的Caspase-8表达水平明显低于正常骨痂组织。且Caspase-8表达与肿瘤细胞病理因素之间的关系与Livin蛋白与肿瘤细胞病理因素之间的关系一致。Caspase-8蛋白在直径较大、Enncking分期处于ⅡB～Ⅲ期和最终生存时间少于5年的患者体内的阳性表达显著下降。进一步分析Caspase-8蛋白和Livin蛋白之间的相关性可以发现，骨肉瘤组织中Caspase-8蛋白的表达与Livin蛋白呈负相关。

由此说明，Livin对细胞凋亡具有抑制作用[13-14]，且也有可能可以抑制Caspase-8蛋白的表达。Caspase-8蛋白介导的细胞外凋亡途径中，Caspase-8蛋白活化Procaspase-3时需要去除prodomain，之后才能启动核心蛋白酶Caspase-3的凋亡作用。Livin蛋白可能可以抑制prodomain的去除，从而抑制之后的一系列凋亡过程[15-20]。根据研究结果，Livin蛋白和Caspase-8蛋白具有作为治疗骨肉瘤基因靶点的潜力。

综上所述，Livin在骨肉瘤组织中表达量显著升高，而Caspase-8在骨肉瘤组织中表达量显著降低，且与骨肉瘤的肿瘤的大小、Enncking分期和患者最终生存时间有关。

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（收稿日期：2016-07-16 本文编辑：任 念）