MicroRNA-31在肝癌中的肿瘤抑制作用

2016-12-23木兰托娅

中国老年学杂志 2016年23期

关键词：癌基因克隆肝癌

木兰托娅

(内蒙古医科大学基础医学院寄生虫学教研室，内蒙古呼和浩特 010059)

MicroRNA-31在肝癌中的肿瘤抑制作用

木兰托娅1

(内蒙古医科大学基础医学院寄生虫学教研室，内蒙古呼和浩特 010059)

目的分析微小RNA-31(MicroRNA-31)在肝癌中的肿瘤抑制作用和影响机制。方法选取2014年6月至2016年1月收治的HBV感染者为研究对象，依照患者病情分为急性肝炎组、慢性肝炎组、肝硬化组、肝癌组，另外选取同期健康体检人员30例作为健康组，采集患者外周静脉血，测定MicroRNA-31表达情况。肝癌手术患者留取肝癌组织和癌旁正常组织，细胞转染，实施平板克隆形成实验。选取健康裸鼠，在无菌条件正常饮食下，将转染肝癌组织经皮下注射置入裸鼠，3 w后处死，取出肿瘤组织，测量体积。同时开展Western印迹，采用实时荧光RNA和免疫组织化学法测定观察。结果感染HBV后，细胞MicroRNA-31存在高表达情况，肝癌组患者组织核细胞MicroRNA-31表达显著高于其他组(P<0.05)。平板克隆实验测定，转染MicroRNA-31的肿瘤细胞克隆数增殖减少50%(P<0.05)。体外成瘤实验，转染MicroRNA-31后的肝癌细胞成瘤能力下降，而且肿瘤体积缩小。Western印迹检测，细胞转染后，LATS2表达水平提高1.5倍，PPP2R2A表达无明显变化，转染LATS2siRNA细胞中LATS2表达显著下降(P<0.05)。MicroRNA-31表达与LATS2呈现负相关(P<0.05)。免疫组织化学法检测显示，肝癌组织中LATS2表达水平显著低于正常组织。结论肝癌组织中MicroRNA-31可能通过调节LATS2抑制肿瘤增殖，MicroRNA有望成为分子指标靶向药物。

肝癌；微小RNA-31;肿瘤抑制；荧光定量RNA

乙型肝炎病毒(HBV)感染与肝癌发生发展有关。HBV感染疾病中，微小(Micro)RNA能够参与调节作用。MicroRNA属于比较保守的单链非编码RNA，能够与靶基因结合〔1〕，调控转录基因的表达，参与多种生理过程，发挥抑癌基因或者癌基因作用。当前研究发现半数以上的MicroRNA基因固定在肿瘤基因相关区域，并且肿瘤发生发展中，常出现异常表达。MicroRNA-31最早在Hela细胞中被发现，位于染色体9P21.3。MicroRNA-31短链非编码RNA长度为18～25个核苷酸〔2〕。当前研究发现MicroRNA-31能够参与多种生物学作用，如细胞增殖、分化、凋亡，很多研究指出MicroRNA-31能够参与肺癌、食管癌等疾病发生进展，不同恶性肿瘤中MicroRNA-31发挥作用的研究结果也不一致〔3〕。本研究重点分析MicroRNA-31在肝癌中的抑制作用和影响机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取2014年6月至2016年1月收治的HBV感染者。纳入标准：均符合急慢性HBV感染纳入标准；排除标准：化疗、其他肝脏疾病、妊娠期、严重肝肾衰竭等患者。依照患者病情分为急性肝炎组、慢性肝炎组、肝硬化组、肝癌组。急性肝炎组30例中男19例，女11例；年龄34～63岁，平均(45.3±7.5)岁。慢性肝炎组29例中男18例，女11例；年龄36～69岁，平均(48.2±10.3)岁。肝硬化28例中男16例，女12例；年龄31～62岁，平均(46.3±8.5)岁。肝癌组32例中男22例，女10例；年龄34～68岁，平均(48.3±9.7)岁。另外选取同期来我院健康体检人员30例作为健康组，男18例，女12例；年龄32～68岁，平均(46.2±9.8)岁。5组患者一般资料具有可比性(P>0.05)。

主要试剂：RNA提取试剂盒(上海岩鑫生物科技有限公司)、RNA酶抑制剂(上海禾兴生物科技有限公司)、RNA-DNA嵌合探针(上海吉玛生物公司)、Trizol(大连宝生物有限公司)、探针序列(上海生工生物有限公司)、微球捕捉序列(Bio-Rad)、DMEM(Gibco公司)、抗体(Abcam公司)、RNA试剂盒(Qiagen公司)、反转录酶(Fermentas公司)。

主要仪器：PCR仪器(Bio-Rad)、Luminex液态芯片分析系统(Luminex)、紫外分光光度计(上海仪电分析仪)、离心机(Termo)。

1.2 方法采集患者外周静脉血5 ml，加入Ficoll提取液，离心，吸出灰色外周血单个核细胞(PBMC)。在PBMC中加入Trizol共1 ml，反复吹打，严格按照说明书抽取总RNA，采用分光光度法测定吸光度。当A260/A280比值1.9～2.1时，加入RNA酶抑制剂。采用RNA-DNA嵌合探针液态芯片检测MicroRNA-31表达情况。实验中用到的探针序列采用Oligo6.0软件设计，由生物工程公司合成，登录号：407035。RNA-DNA嵌合探针序列：AGC AUG CCA GCA AGC AUC UUG CUC CGC CGT TGT CCT GTC；微球捕捉DNA序列：GAC AGG ACA ACG GCG G。检测时，取3次荧光信号平均读数作为有效数值。

肝癌患者采取手术治疗，留取肝癌组织和正常癌旁组织。细胞转染，严格按照脂质体说明书操作。转染4 h后换培养液，在孵箱中继续培养。

实施平板克隆形成实验。转染细胞接种到孔板中，每3 d换培养液，直至大部分肿瘤细胞克隆成功，PBS清洗并计数。

建立肿瘤模型。获得动物管理委员会批准，选取健康裸鼠(SCXK2014-0002)，在无菌条件正常饮食下，将转染的肝癌组织经皮下注射置入裸鼠，3 w后处死，取出肿瘤组织，测量体积。

Western印迹。将细胞转染LATS2的MicroRNA表达作为对照，转染48 h后，分析LATS2表达。采用PBS溶液清洗裂解细胞，蛋白浓度采用BCA法测定，同时采用SDS-PACE胶分析，分析条带强度。

采用实时荧光RNA和免疫组织化学法测定观察。严格按照RNA提取试剂盒操作，RNA浓度采用NanoDropND-1000分光光度计法测定，取500 ng RNA合成CDNA后进行PCR反应。将肿瘤组织切片脱水处理，加入3%医用双氧水，孵育5 min，清晰后采用PBS洗涤，山羊血封闭，滴加一抗孵育；然后采用生物素标记的二抗孵育，最后滴加辣根酶标记，显微镜下观察。

将含有MicroRNA-31结合位点的LATS克隆到载体GFP下游，细胞转后，转染RFP作为内参，转染48 h后，测定GFP荧光度。

1.3 统计学分析采用SPSS19.0软件行t检验。

2 结果

2.1 HBV感染不同时期MicroRNA-31表达比较感染HBV后，细胞MicroRNA-31存在高表达情况。不同病情，MicroRNA-31表达存在一定差异。健康组MicroRNA-31表达水平(0.56±0.19)最低，肝癌组患者组织核细胞MicroRNA-31表达(0.83±0.31)显著高于其他组(急性肝炎组、慢性肝炎组、肝硬化组分别为0.58±0.21、0.62±0.30、0.71±0.28)(P<0.05)。

2.2 平板克隆形成实验利用平板克隆实验测定转染细胞、SLC-1 细胞和MicroRNA-31ASO细胞生长情况。与对照组比较，转染MicroRNA-31的肿瘤细胞克隆数增殖减少50%，差异显著(P<0.05)。

2.3 体外成瘤实验将对照细胞以及转染MicroRNA-31细胞注入到裸鼠体内，结果显示，转染MicroRNA-31后的肝癌细胞成瘤能力下降，而且肿瘤体积缩小。见图1、图2。

图1 体外成瘤实验肿瘤体积观察

图2 MicroRNA-31对肝癌细胞生长的影响

2.4 Western印迹检测细胞转染后，LATS2表达水平提高1.5倍，PPP2R2A表达无明显变化。

2.5 预测MicroRNA-31候选靶基因生物学信息学法测定，MicroRNA-31与LATS2结合位点互补。

2.6 GFR报道载体实验验证MicroRNA-31靶基因对照设为1，转染MicroRNA-31细胞LATS2 3/UTR强度增强(1.5)，MicroRNA-31转染对突变荧光强度(OP)无明显影响。

2.7 MicroRNA-31对LATS2表达的影响对照设为1，转染LATS2 siRNA细胞中LATS2表达(0.2)显著下降(P<0.05)。

3 讨论

MicroRNA是乙组内源性非编码单链小RNA，能够广泛参与细胞增殖、分化以及炎症等生理过程，能够与目的基因3/端非编码结合，通过降低信使RNA含量，组织DNA的翻译。当前MicroRNA已经发现1 400多种，由于其广泛具有生物学作用〔4〕，研究MicroRNA-31对肝癌细胞生物学作用对分子靶向治疗有重要理论价值和现实意义。

有关MicroRNA-31的研究论文较多，多集中在皮肤癌、乳腺癌、食管癌等恶性肿瘤研究中，肝癌方面的研究不多〔5〕。研究证实MicroRNA在调节肿瘤生物学作用时，能够发挥类似抑癌基因或者癌基因作用。关于不同MicroRNA的表达研究观点也存在一定差异。多数学者认为在大多数的肿瘤细胞中，MicroRNA-31均呈现高表达，认为在恶性肿瘤发生发展中，MicroRNA-31能够发挥癌基因的效果〔6〕。但是有关MicroRNA-31的研究观点却都存在较大的差异。乳腺癌研究中，发现MicroRNA-31能够参与肺部转移灶荷瘤减少，抑制乳腺癌的活动性、侵袭性，认为在乳腺癌中，MicroRNA-31属于一种抑癌基因。在结肠癌相关研究中，发现MicroRNA-31高表达会提高肿瘤的侵袭性〔7〕，认为MicroRNA-31同样具有癌基因的特点。MicroRNA-31在不同肿瘤中的研究观点一直没有统一，结肠癌、肺癌等高表达，卵巢癌、胃癌中则呈低表达。

有学者分析MicroRNA-31表达对肝纤维化的影响〔8〕，发现MicroRNA-31的表达受到TGF-β1的影响，认为MicroRNA-31表达与肿瘤血管生长有关〔9〕。本组临床研究以HBV感染患者为研究对象，提示MicroRNA-31表达水平与HBV感染密切相关，可能参与病情进展，MicroRNA-31在肝癌中能够发挥癌基因作用。MicroRNA-31在其他恶性肿瘤中发现存在高表达情况，如在皮肤癌患者中miR-31呈现高表达，并且与患者病情严重程度、预后相关〔10〕。为进一步分析MicroRNA-31对肝癌恶性肿瘤细胞生长的影响，在以往研究中发现MicroRNA-31能够参与血管平滑肌的生长，认为MicroRNA-31表达与肿瘤进展有关〔11〕。本组研究结果，提示MicroRNA-31在恶性肿瘤发生发展中是癌基因的角色。

有学者发现MicroRNA与靶基因3/UTR并不是完全互补的，因此多认为MicroRNA-31能够通过调节多个靶基因表达发挥癌基因作用〔12〕。有学者对肺癌患者进行研究，发现MicroRNA-31能够通过影响LATS2以及PPP2R2A参与肿瘤细胞的生长。LATS2位于13号染色体上，能够编码蛋白激酶；很多学者在研究中发现，LATS2编码的蛋白酶属于肿瘤抑制信号途径，能够诱导癌基因失活，达到抑制肿瘤细胞生长作用。本组研究结果显示MicroRNA-31能够参与调节LAST2蛋白的表达，但是并没有影响PPP2R2A表达，可能是因为不同肿瘤细胞中PPP2R2A的表达也存在变化，这点在皮肤癌研究中也观察到。通过GFR实验报告进一步证实MicroRNA-31能够直接作用LATS1，MicroRNA-31抑制肿瘤细胞增殖可能是通过与3/URT结合抑制LATS2的表达，进而促进恶性肿瘤细胞增殖。采用实时定量PCR测定以及免疫组织化学法分析，肝癌汇总LATS1表达降低，敲除该基因后，细胞增殖能力增强，与转染MicroRNA-31的相反，进一步说明LATS2是MicroRNA-31的靶基因，未来基因靶向治疗中，可以考虑抑制MicroRNA-31表达，提高LATS2的水平。

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