王永刚, 孙尚琛, 马雪青, 秦健宇, 冷非凡

(1.兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050； 2.中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)



Ca2+和Sr2+诱导大肠埃希菌感受态细胞的形成及转化的影响

王永刚1, 孙尚琛1, 马雪青2, 秦健宇1, 冷非凡1

(1.兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050； 2.中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)

为研究金属离子诱导下感受态细胞形成的机理及揭示转化发生的机制，分别用Ca2+和Sr2+(0～140 mmol/L)制备大肠埃希菌感受态细胞并转化。研究结果表明，不同浓度的Ca2+和Sr2+诱导的感受态细胞的效价不同，两种金属离子对大肠埃希菌细胞内外膜的通透性均有较大影响，但细胞内外膜的改变程度与转化率无直接关系；电镜结果显示，未处理的细胞呈簇聚集发生粘连现象，感受态细胞整体呈分散状态，局部发生聚集，而转化后的细胞独立存在，边缘异常清晰。

Ca2+； Sr2+； 通透性； 感受态细胞；转化

质粒转化感受态细胞是基因工程中常用的手段之一。早在1970年，Mandel等[1]研究发现，一定浓度的Ca2+可以诱导大肠埃希菌形成感受态细胞，摄取外源DNA。Chu等[2]从Micromonosporaechinospora的细胞壁中提取肽聚糖并研究了肽聚糖、庆大霉素和金属离子之间的吸附关系。研究发现，金属离子与庆大霉素可以竞争性吸附肽聚糖，在金属离子存在下，肽聚糖对庆大霉素的吸附量很少。 Subrata等[3]研究发现DNA与脂多糖(LPS)有较强的结合作用，且DNA-LPS复合物在Ca2+浓度为100 mmol/L时结合作用最强，DNA的超螺旋结构最紧密。关于金属离子在感受态细胞的形成及转化发生中的生理机制尚不明确，一般认为是宿主细胞在低温、金属离子的刺激等条件下，细胞膜的通透性发生了变化，进而为外源DNA的进入提供了条件。本研究利用Ca2+和Sr2+诱导大肠埃希菌细胞，研究两种金属离子对宿主细胞膜通透性及质粒转化率的影响，并采用电镜等手段对宿主细胞的形态等进行研究，以期揭示金属离子对宿主细胞生理性调节的相关作用，探索金属离子诱导下感受态细胞的形成及转化发生的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大肠埃希菌DH5α，由兰州理工大学马建忠实验室保存。

1.1.2 质粒 质粒DNA pUC19(AMP+)，为本实验室保存。

1.1.3 培养基 LB培养基(体积分数，%)：每1 000 mL培养基中含蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；抗性平板：LB培养基加氨苄青霉素至终浓度50 μg/mL，琼脂1.5%(体积分数)。

1.2 方法

1.2.1 感受态细胞的制备 依据文献[4]提供的制备感受态细胞的方法，分别用浓度为0、60、80、100、120 和140 mmol/L的Ca2+和Sr2+制备大肠埃希菌DH5α感受态细胞，于-80 ℃下保存于终浓度为15%的甘油中，备用。

1.2.2 不同离子浓度对大肠埃希菌内膜(IM)通透性影响的检测 将已活化的大肠埃希菌按1%的量接种至含2%乳糖的LB液体培养基中，37 ℃恒温振荡(180 r/min)培养2～3 h至对数期(OD600=0.4～0.6)，收集细胞，经过生理盐水洗涤后分别用浓度为0、60、80、100、120 和140 mmol/L的Ca2+与Sr2+制备大肠埃希菌DH5α感受态细胞。在感受态细胞中加入终浓度为1.5 mmol/L 的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)[5]，37 ℃轻微震动2 min，溶液颜色呈黄色后用紫外分光光度计测量不同浓度下415 nm处的吸光值，3组平行，绘制曲线。1.2.3 不同离子浓度对大肠埃希菌外膜(OM)通透性影响的检测 在1.2.1方法制备的感受态细胞中加入终浓度为10 μmol/L的N-苯基-1-萘胺(NPN)[5]溶液，37 ℃轻微振荡2 min后用荧光分光光度计测量其荧光值：激发波长350 nm，发射波长420 nm。每个浓度下做3组平行，记录数值并绘制标准曲线。

1.2.4 不同离子浓度对质粒pUC19转化大肠埃希菌DH5α转化率的影响 各个浓度的Ca2+与Sr2+介导下的感受态细胞200 μL和2 μL质粒(pUC19)吹吸混匀，冰上放置30 min后42 ℃热激90 s，快速将离心管转入冰上放置3 min，加入800 μL不含抗生素的LB培养基，37 ℃振荡培养45 min，取10 μL菌液加入490 μL LB培养基，吹吸均匀后再从稀释液中取10 μL加入190 μL无菌水，涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基中，37 ℃培养16 h，计数。

1.2.5 扫描电镜的样品制备 取对数培养期的大肠埃希菌悬浮液，3 000 r/min离心5 min，弃上清液，向大肠埃希菌沉淀中加入菌体体积40倍的2.5%戊二醛混匀，使其成为悬浮液, 静置固定2 h；再以3 000 r/min离心5 min，沉降细菌，弃上清液；以蒸馏水重新悬浮菌体沉淀，再以 3 000 r/min离心5 min，弃上清液，重复3次，以清洗细菌；然后依次把30%、50%、70%、80%、90%的梯度浓度酒精加入细菌沉淀，脱水，每次悬浮混匀后静置10 min再离心，弃去上清液，加入下一梯度浓度的酒精重复以上操作，然后用纯酒精按同样方法将细菌脱水3次，30 min /次；接着换用纯叔丁醇代替酒精离心置换酒精3次，30 min/次；最后用叔丁醇将菌体沉淀悬浮成浓度为105个/mL 吸取悬液，滴在覆有盖玻片的样品台上，置于-10 ℃预冷的冷冻干燥机内进行真空干燥。将以上干燥脱水后的大肠埃希菌用镀膜仪以10 Pa 的真空度，15 mA的离子电流镀金160 s并拍照[6-10]。

1.2.6 荧光显微镜观察 用丙酮配制2 mg/mL的FDA贮备液，按菌含量1×106个/mL的要求加入125 μL FDA液，使FDA终浓度为0.25 mg/mL，20 ℃反应5 min后，制片并在荧光显微镜下观察[11-13]。

2 结果与分析

2.1 Ca2+对大肠埃希菌内膜通透性和质粒DNA转化率的影响

图1为Ca2+对大肠埃希菌内膜通透性的变化及转化率的影响。当Ca2+浓度小于100 mmol/L时，随着Ca2+浓度的增加质粒DNA的转化率增大，在Ca2+浓度为100 mmol/L时转化率达到最大，随后随着Ca2+浓度的逐渐增大，转化率呈下降趋势。与此同时，随着Ca2+浓度的增大，内膜的通透性逐渐增高，但转化率与内膜通透性的变化并不完全呈正相关。

图1 Ca2+对大肠埃希菌内膜通透性的变化及转化率的影响

Fig.1 The effect on inner membrane permesbility and transformation ofE.coliby Ca2+

2.2 Ca2+对大肠埃希菌外膜通透性和质粒DNA转化率的影响

Ca2+对大肠埃希菌外膜通透性的变化和转化率的影响如图2所示。当Ca2+浓度小于100 mmol/L时，质粒DNA转化率与Ca2+浓度呈正相关，外膜通透性在Ca2+浓度为80 mmol/L时达到最大。而当Ca2+浓度大于100 mmol/L时，由于离子浓度过大，细胞失水破裂失去活性，转化率和外膜通透性减小。

图2 Ca2+对大肠埃希菌外膜通透性的变化及转化率的影响

Fig.2 The effect on outer membrane permesbility and transformation ofE.coliby Ca2+

2.3 Sr2+对大肠埃希菌内膜通透性和质粒DNA转化率的影响

由图3可看出，随着Sr2+浓度的变化大肠埃希菌内膜的通透性和转化率均发生变化。当Sr2+浓度为80 mmol/L时，大肠埃希菌内膜的通透性最强，随着离子浓度的增大，内膜通透性逐渐减弱，而质粒DNA的转化率在Sr2+浓度小于100 mmol/L时逐渐增大，在100 mmol/L时达到最大，随后由于Sr2+浓度过大导致细胞失水破裂丧失活性，转化率逐渐降低。

图3 Sr2+对大肠埃希菌内膜通透性的变化及转化率的影响影响

Fig.3 The effect on inner membrane permesbility and transformation ofE.coliby Sr2+

2.4 Sr2+对大肠埃希菌外膜通透性和质粒DNA转化率的影响

Sr2+对大肠埃希菌外膜通透性和质粒DNA转化率的影响如图4所示。当Sr2+浓度为60 mmol/L时，外膜的通透性达到最强，Sr2+浓度为100 mmol/L时转化率最大。

图4 Sr2+对大肠埃希菌外膜通透性的变化及转化率的影响

Fig.4 The effect on outer membrane permesbility and transformation ofE.coliby Sr2+

2.5 Sr2+和Ca2+介导质粒DNA转化感受态细胞转化率的比较

图5为Sr2+和Ca2+诱导下转化率的变化。离子浓度<100 mmol/L时，Ca2+介导的细胞转化率明显高于Sr2+；离子浓度为100 mmol/L时，二者的介导作用相当；当离子浓度>100 mmol/L时，Sr2+介导的细胞的转化率略高于Ca2+。

图5 Sr2+和Ca2+介导大肠埃希菌感受态细胞的转化率

Fig.5 The transformation efficiency ofE.colicompetent cells induced by Sr2+and Ca2+, respectivly

2.6 Ca2+处理前后大肠埃希菌细胞傅里叶红外光谱

Ca2+处理前后大肠埃希细胞红外光谱如图6所示。在3 750～3 000 cm、1 800～1 500 cm、1 500～1 000 cm均有特征吸收峰。在3 750～3 000 cm处有宽展圆滑的强吸收峰O-H键的伸缩振动；在1 800～1 500 cm处的吸收峰为-OH的变形振动；1 500～1 000 cm处的吸收峰为C-O的伸缩振动。对比a、b和c可以看出，b感受态细胞在1 500～2 000 cm处的强度增强，有蛋白质和肽段的酰胺吸收区域(1 800～1 500 cm)；在3 400cm处(N-H和O-H键)的吸收峰感受态a、b要比参照组c宽。

图6 Ca2+处理前后大肠埃希菌细胞的傅里叶红外光谱

Fig.6 The FT-IR spectrum ofE.coliunder pre-and post-treatment by Ca2+

a:转化后细胞的红外光谱；b：Ca2+作用后的感受态细胞的红外光谱；c：未被Ca2+处理的大肠埃希菌细胞红外光谱

a:IR spectrun of transformation cells;b:IR spectrun of competent cells treated by Ca2+;c:IR spectrun of nature cells

2.7 扫描电镜结果

扫描电镜结果见图7。未被Ca2+处理的大肠埃希菌细胞(图7a)呈簇聚集，细胞发生粘连现象且边缘较清晰，表面有微小的凸起；Ca2+处理后的感受态细胞(图7b)整体呈分散状态，局部发生聚集，细胞发生失水皱缩，表面出现很大的凹陷发生空化并有褶皱；转化后的大肠埃希菌(图7c)细胞融合了外源DNA呈独立存在状态，边缘异常清晰，表面凸起并有细小亮光，细胞饱满表面光滑度提高，亮度增强。

图7 Ca2+处理前后大肠埃希菌细胞表面结构

Fig.7 The cells surface structure ofE.coliunder pre-and post-treatment by Ca2+

A：原始细胞；b：感受态细胞；c：转化后的大肠埃希菌

a:primitive cells;b:competent cells;c:transformed cells

2.8 Ca2+与Sr2+介导后的大肠埃希菌荧光图片

图8为大肠埃希菌在Ca2+和Sr2+作用下的荧光图片。由图8可知，未被Ca2+处理的细胞内外膜较完整，荧光素FDA无法进入细胞内产生荧光，故在荧光显微镜下无法展现荧光。但在Ca2+和Sr2+的作用下，大肠埃希菌细胞内外膜的通透性发生了改变，荧光素FDA进入细胞后发生水溶性反应进而产生荧光。

图8 Ca2+ 、Sr2+ 作用前后的大肠埃希菌在荧光显微镜下的照片Fig.8 The fluorescent images of E.coli under under pre-and post-treatment by Ca2+ and Sr2+, respectivly a:原始大肠埃希菌DH5α； b: Ca2+处理大肠埃希菌DH5α；c: Sr2+处理大肠埃希菌DH5αa: primitive cells DH5α；b:E.coli DH5α treated by Ca2+； c: E.coli DH5α treated by Sr2+

3 讨 论

本研究从宏观和微观层面研究了不同浓度的Ca2+和Sr2+对大肠埃希菌细胞膜及对质粒DNA转化大肠埃希菌的影响，以期揭示金属离子介导的感受态细胞的形成及转化发生的生物学机制。结果发现：Ca2+与Sr2+均能介导质粒DNA转化进入大肠埃希菌细胞，且在浓度为100 mmol/L时二者的转化率一致；两种金属离子的诱导对宿主细胞内外膜的通透性有很大影响，但细胞内外膜通透性的强弱与转化率并无明显的相关性；电镜观察结果显示：在金属离子的作用下胞内物质释放，导致大肠埃希菌细胞发生了明显的空化现象，细胞变的光滑独立，而转化后的细胞形态饱满[14]，菌体表面亮度增加[15]。以上结果表明，二价的金属离子能够诱导感受态细胞的形成及转化的发生，但金属离子是否最终作用于肽聚糖，为DNA进入宿主细胞提供离子通道还是改变了宿主细胞的物理结构只是一种猜测，有待进一步研究论证。

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The Effects of Ca2+, Sr2+on the Induction of the Formation and Transformation ofE.coliCompetence Cells

WANG Yong-gang1, SUN Shang-chen1, MA Xue-qing2, QIN Jian-yu1, LENG Fei-fan1

(1.LanzhouUni.ofTechnol.;Schl.ofSci. &Engin.,Lanzhou730050; 2.LanzhouVet.Res.Inst.,ChineseAcad.ofAgric.Sci.,Lanzhou730046)

In order to study the formation mechanism of competence cells under the induction of metal ions and reveal the transformation mechanism, Ca2+and Sr2+(0～140 mmol/L) were respectively used in this study to prepareE.colicompetence cells and transform them. The results showed that the valence of competence cells induced by different concentration of Ca2+; Sr2+ions was different and the two metal ions all had fairly large effects onE.colicell internal and external membrane permeability, however, no direct relation to the degree of variation and transformation rate of the cell internal and external membrane. The results of EM observation showed that the untreated cells were adhered with each other into cluster; but the competence cells were disperse in total, adhered partly; the existence of cells after transformation were independent with clear edges.

Ca2+; Sr2+; permeability; competence cells; transformation

国家自然科学基金项目(31460032)；甘肃省自然科学基金项目(1308RJZA287)；兰州理工大学红柳青年计划项目(10-061406)

王永刚 男，硕士，讲师。研究方向为微生物生理与遗传转化。E-mail：412316788@qq.com

孙尚琛 男，硕士研究生。研究方向为微生物生理与遗传转化。E-mail：597520119@qq.com

2015-06-02；

2015-08-07

Q932

A

1005-7021(2016)02-0020-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.004