郑守晶, 王益晨, 杨慧芳, 郑明锋*

(1.福建农林大学金山学院， 福建 福州 350002；2.福建农林大学食品科学学院， 福建 福州 350002)



响应面法优化纤维素酶提取真姬菇SDF工艺研究

郑守晶1, 王益晨2, 杨慧芳1, 郑明锋2*

(1.福建农林大学金山学院， 福建 福州 350002；2.福建农林大学食品科学学院， 福建 福州 350002)

以真姬菇(Hypsizigusmarmoreus)下脚料为原料，采用纤维素酶提取可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber,SDF)，在加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解pH等单因素试验的基础上，采用响应面法分析优化工艺参数。结果表明，最佳提取工艺：纤维素酶添加量为0.57%、酶解温度为57.98 ℃、酶解时间为3.70 h、酶解pH为5.15，在此条件下，真姬菇SDF提取率达到10.20%。

真姬菇; 可溶性膳食纤维; 纤维素酶; 提取

膳食纤维不能被人体肠道的消化酶所分解，属于广大碳水化合物中的一种多糖类物质，适量的摄入膳食纤维对人体的健康有着很大的改善作用(林德荣，2008)。根据膳食纤维在水里溶解与否可将膳食纤维分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)和非可溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)。

SDF是指能溶解于水又能吸水使其膨胀的多糖类物质，且能被大肠中微生物酵解的一类纤维，主要有果胶、植物胶、葡聚糖、树胶琼脂等(陶颜娟，2008)，主要存在于植物细胞液和细胞间质中，对人体健康十分有益，例如降血糖、降血脂、预防食道癌、预防肿瘤等。近些年来，SDF基于其特殊的生理功能已经越来越受到人们青睐和科研的重视。

真姬菇(Hypsizigusmarmoreus)属于木质腐生真菌，不但外形好看，味道鲜美，还具有很高的营养价值(Tsai et al.，2013)，所以越来越受到人们的喜爱。真姬菇中含有很多优质的营养成分，钠、钾、钙、锌、铁、磷的含量也极为丰富，维生素B1、B2、B6的含量也比一般的食用菌高。本文预试验的结果表明真姬菇干粉的SDF含量高达10%左右，SDF具有降血糖、延缓衰老、降血压等药理功效，是一种不可多得的物质，值得开发利用。但是传统的酶-重量法和热水浸提法对物料SDF的提取率不高，都是只能提取物料本身固有的SDF，不能增加其含量(Chawla et al.，2010)；本试验以真姬菇下脚料为原料，采用纤维素酶提取法，纤维素酶能把真姬菇中的非SDF部分降解，使部分非SDF转变成SDF，提高其提取率。该提取工艺的研究，不仅能降低生产成本，而且高提取率可以提升真姬菇产业的核心竞争力，产生良好的经济和社会效益。

1 材料与方法

1.1 试验材料

真姬菇：购于福建省福州市永辉超市。

1.2 试验主要试剂

纤维素酶(10 万u·g-1)：由宁夏和氏璧生物技术有限公司提供；浓硫酸、苯酚、无水乙醇、柠檬酸、碳酸钠，以上试剂均为市售分析纯。

1.3 试验仪器

HH-4型数显恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；RE52-99型旋转蒸发仪(江苏康健医疗用品有限公司)；漩涡振荡仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV-1800PC型紫外分光光度计(上海亚荣生化仪器厂)；循环水式真空泵[奥豪斯仪器(上海)有限公司]；pH计[奥豪斯仪器(上海)有限公司]；ZNC-300型高速粉碎机(北京兴时利和科技发展有限公司)；DHG-9123A电热热风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)； DGH-9123A低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.4 纤维素酶法提取真姬菇SDF优化工艺

1.4.1 纤维素酶法提取真姬菇SDF的方法 真姬菇下脚料表面用清水充分洗净，采用热风干燥的方法干燥，将干燥后的子实体用粉碎机粉碎，过100目分离筛。将粉碎好的真姬菇粉末加入一定量的超纯水，用柠檬酸和碳酸钠调整pH,精确称取适量的酶加入溶液中混合，在水浴中恒温酶解，每隔5 min搅拌一次，使酶和物料充分混合反应，酶解完成后将其放入100 ℃水浴中10 min，使酶失去活性。将反应液移入大容量离心机离心，取上清液，真空浓缩后加入4倍浓缩液体积的无水乙醇静置4 h，再置于大容量离心机中以4000 r·min-1的速度离心10 min，去上清液，收集沉淀，沉淀即是粗SDF，把收集到的沉淀干燥称重。

(1)

1.4.2 纤维素酶提取真姬菇SDF的单因素试验设计 取2 g真姬菇干粉，分别加入0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%纤维素酶进行酶解(Ma et al.，2016)，固定其他条件，分别考察酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)(Sun，2007)、酶解时间(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)(Li et al.，2014)、酶解pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)(Mu et al.，2012)对真姬菇SDF提取率的影响。每组平行3次试验，取平均值。

1.4.3 纤维素酶提取真姬菇SDF的中心组合试验设计 运用Design Expert(version8.0.3)软件中的Central Composite分析试验(李珍等，2013)，在单因素分析的基础上，以纤维素酶的条件因素(温度、时间、pH、加酶量)为指标，每个因素设定五个水平(赵强等，2012；林建原等，2013)，通过响应面分析各因素和因素间交互作用的显著性(张术易，2012；侯学敏等，2013)。试验因子及水平编码如表1所示，每组试验重复3次，取平均值。

表1 Central Composite 试验因子水平编码表

Table 1 Central Composite coding table of experimental factors and levels

水平编码因 素加酶量/%酶解温度/℃酶解时间/hpH20.9603.56.010.7553.05.500.5502.55.0-10.3452.04.5-20.1401.54.0

2 结果与分析

2.1 纤维素酶单因素分析

2.1.1 纤维素酶添加量对真姬菇SDF提取率的影响 由图1可知，纤维素酶的添加量在0.5%时，真姬菇SDF的提取率达到最高，低于或高于0.5%时，提取率都低于这个水平。说明加酶量过低时，造成底物的饱和，加酶量不足以应付所有的底物，酶解效率不高；当纤维素酶添加量过大时，SDF的提取率反而下降，应该是过量的纤维素酶会使已经溶出的部分SDF降解成小分子物质，不容易被无水乙醇醇沉，造成真姬菇SDF提取率的下降(Hou et al.，2009)。

图1 酶添加量对真姬菇SDF提取率的影响

Figure 1 Effect of cellulase dosage on SDF extraction rate ofH.marmoreus

2.1.2 酶解温度对真姬菇SDF提取率的影响 由图2可知，纤维素酶的提取温度在50 ℃时SDF有最高的提取率，过低的温度或过高的温度都没有50 ℃时的提取率高。根据酶学原理，酶在最适温度时作用效果最好。当温过高时，酶的活力会下降，作用效果降低，导致真姬菇SDF提取率下降；当温度过低时，酶的活性受到抑制，导致提取率下降。

2.1.3 酶解时间对真姬菇SDF提取率的影响 由图3可知，酶解时间对真姬菇SDF提取有一定的影响，提取时间从开始到3 h,SDF提取率不断增加，但时间超过3 h后,提取率反而下降，可能是纤维素酶会继续发挥降解作用，造成SDF分解成更小的糖类分子，不容易被无水乙醇醇沉。

图2 酶解温度对真姬菇SDF提取率的影响

Figure 2 Effect of enzymolysis temperature on SDF extraction rate ofH.marmoreus

图3 酶解时间对真姬菇SDF提取率的影响

Figure 3 Effect of enzymolysis time on SDF extraction rate ofH.marmoreus

2.1.4 酶解pH对真姬菇SDF提取率的影响 由图4可知，在酶解pH为5时提取率达到最高，pH过高或过低时都没有达到较高的提取率。酶解pH不适应酶本身的酶解条件时，酶的活性或被部分抑制或全部丧失，因为多数酶本身也属于蛋白质，过高或过低的pH会造成蛋白质的变性，也就是造成酶的失活。

图4 酶解pH对真姬菇SDF提取率的影响

Figure 4 Effect of enzymolysis pH on SDF extraction rate ofH.marmoreus

2.2 纤维素酶提取真姬菇SDF中心组合试验

2.2.1 中心组合试验结果 根据中心组合试验方案进行4因素5水平试验，试验结果如表2所示。对表2中的试验数据用多元回归拟合后，得到回归方程为：

Y=10.05-0.078X1+0.14X2+0.18X3+0.079X4-0.14X12-0.13X22-0.17X32-0.20X42+0.039X1X2-0.03X1X3-0.041X1X4+0.095X2X3+0.029X2X4-0.072X3X4。

式中：X1表示加酶量，X2表示酶解温度，X3表示酶解时间，X4表示酶解pH。

表2 响应面分析方案及试验结果

Table 2 The design and results of response surface analysis

编号因 素加酶量/%酶解温度/℃酶解时间/hpHSDF提取率/%编号因 素加酶量/%酶解温度/℃酶解时间/hpHSDF提取率/%1-1-1-1-19.131611119.7621-1-1-19.0017-20009.643-11-1-19.101820009.42411-1-19.05190-2009.215-1-11-19.452002009.9061-11-19.292100-209.037-111-19.792200209.738111-19.7423000-29.099-1-1-119.452400029.44101-1-119.1525000010.0611-11-119.5226000010.001211-119.3427000010.0913-1-1119.5428000010.01141-1119.1029000010.0615-11119.8930000010.05

2.2.2 回归模型的方差分析 由表3可知，失拟项F1=2.91(P>0.05)不显著，说明模型的拟合较为合适，决定系数R2=0.9900，说明回归方程是很合理的，达到了极显著水平，所以4因素5水平的真实数据在此方程的模拟下是可行的。交互项中X1X2、X2X3、X1X4、X3X4的回归系数达到极显著水平(P<0.01)，X2X4的回归系数达到显著水平(P<0.05)，去除不显著项X1X3，将原始方程简化后得到新的回归方程为：

Y=10.05-0.078X1+0.14X2+0.18X3+0.079X4-0.14X12-0.13X22-0.17X32-0.20X42+0.039X1X2-0.041X1X4+0.095X2X3+0.029X2X4-0.072X3X4。

表3 回归模型方差分析1)

Table 3 The variance analysis of regression model

1)*表示回归系数达0.05显著水平；**表示回归系数达0.01极显著水平

2.2.3 因素交互效应分析 通过Design Expert软件对交互项X1X2、X2X3、X1X4、X3X4和X2X4进行响应面分析，绘制因素间交互作用的响应面曲线图，如图5-9所示。

(a)等高线图 (b)响应面图

图5 加酶量和酶解温度的交互作用对真姬菇SDF提取率的影响

Figure 5 Effect of interaction between enzyme dosage and enzymolysis temperature on SDF extraction rate ofH.marmoreus

(a)等高线图 (b)响应面图

图6 加酶量和酶解pH的交互作用对真姬菇SDF提取率的影响

Figure 6 Effect of interaction between enzyme dosage and enzymolysis pH on SDF extraction rate ofH.marmoreus

(a)等高线图 (b)响应面图

图7 酶解温度和酶解时间的交互作用对真姬菇SDF提取率的影响

Figure 7 Effect of interaction between enzymolysis temperature and enzymolysis time on SDF extraction rate ofH.marmoreus

(a)等高线图 (b)响应面图

图8 酶解温度和酶解pH的交互作用对真姬菇SDF提取率的影响

Figure 8 Effect of interaction between enzymolysis temperature and enzymolysis pH on SDF extraction rate ofH.marmoreus

(a)等高线图 (b)响应面图

图9 酶解时间和酶解pH的交互作用对真姬菇SDF提取率的影响

Figure 9 Effect of interaction between enzymolysis time and enzymolysis pH on SDF extraction rate ofH.marmoreus

对比响应面的三维立体图，在试验所选范围内有极值，即响应面会出现最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点。如图5所示，由等高线的中心红点和其对应的坐标轴可以看出，在加酶量为0.64%、酶解温度为50 ℃的条件下，真姬菇SDF有最高的提取率，温度的抛物线较为平缓，加酶量的抛物线坡度较为陡峭，说明温度对提取率的影响没有加酶量显著。由图6可以看出，等高线图的中心点显示加酶量为0.65%、酶解pH为5的时候，真姬菇SDF的提取率达到最高值，响应面图显示两因素都成抛物线，说明加酶量和环境pH对真姬菇SDF的影响都有一个适中范围，过大或过小都会降低提取率。图7表明，在酶解温度为52 ℃、提取时间在3 h，SDF提取率最高，因为过高的温度会使酶失活，过长的酶解时间会使SDF进一步降解，这些都会降低提取率。由图8可知，酶解温度和酶解pH对真姬菇SDF的提取率影响都成抛物线趋势，但是在适当的酶解温度和酶解pH下可以使提取率达到最高。由图9可知，在酶解时间为3.1 h，酶解pH为5的时候，真姬菇SDF的提取率达到最大，因为过长的酶作用时间会使SDF降解，成为不能被醇沉的物质。

综上所述，要达到最佳的真姬菇SDF提取率，纤维素酶添加量为0.66%左右，酶作用时间在3.0-3.2 h之间，酶解温度在50-52 ℃之间，酶解pH为5。总体上看这4个试验因素对SDF提取率的影响除了因素的线性惯性外，交互项和平方项对响应值也有很大影响。

2.2.4 最适条件优化及验证性试验 根据模型和回归方程所得的真姬菇干粉优化条件结果为：纤维素酶添加量为0.57%、酶解温度为57.98 ℃、酶解时间为3.70 h、酶解pH为5.15，在此条件下SDF提取率的最大理论值为10.20%。

为了检验上述模型的可靠性，根据上述最佳工艺进行验证性实验。为了实验的方便性，选取纤维素酶添加量为0.6%、酶解温度为58 ℃、酶解时间为3.5 h、酶解pH为5做三次重复性实验，测得真姬菇SDF提取率为(10.18±0.39)%，和模型的预测值十分接近，表明此回归模型的预测准确性较高，具有实用价值。

3 小结与讨论

本试验采用纤维素酶提取真姬菇的可溶性膳食纤维。在单因素试验的基础上采用响应面法建立SDF提取率与加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解pH之间的二次回归模型，通过回归方程优化获得了最佳提取工艺参数为纤维素酶添加量为0.6%、酶解温度为58 ℃、酶解时间为3.5 h、pH为5。在此条件下提取率可达(10.18±0.39)%，与预测值(10.20%)基本一致。综合来看，本模型具有较好的预测性能，对生产实践具有一定的借鉴意义。

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(责任编辑：陈晓雯)

Optimization of the SDF extraction ofHypsizigusmarmoreusby cellulase

ZHENG Shou-Jing1， WANG Yi-Chen2， YANG Hui-Fang1， ZHENG Ming-Feng2*

(1.JinshanCollegeofFujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou，Fujian35002，China;2.CollegeofFoodScience，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou，Fujian35002，China)

Cellulase was prepared for extracting the soluble dietary fiber(SDF)from Hypsizigus marmoreus scraps. The technological parameters such as enzymatic amount, enzymolysis temperature, enzymolysis time and enzymolysis pH value were subjected to the single factor test, and optimized by response surface analysis. The results showed that the extraction rate could be up to10.20%, when the enzymatic amount was 0.57%, enzymolysis temperature 57.98 ℃, enzymolysis time 3.70 h and the pH 5.15.

Hypsizigusmarmoreus； soluble dietary fiber； cellulase；extraction

2016-08-30; 发表日期： 2016-10-31

郑守晶(1985-)，女，硕士，助教。研究方向：农产品加工及贮藏工程。Email:417734132@qq.com。*

TS209； TQ925

A

1001-4276-(2016)01-0119-08

郑守晶，王益晨，杨慧芳，等,2016.响应面法优化纤维素酶提取真姬菇SDF工艺研究[J].武夷科学，32：119-126.