李 菲， 王 忠， 卞文印， 黄宝菊

(安发(福建)生物科技有限公司， 福建 宁德 352100)



添加蚕蛹粉对蛹虫草生长及子实体有效成分的影响

李 菲， 王 忠， 卞文印， 黄宝菊

(安发(福建)生物科技有限公司， 福建 宁德 352100)

在大米培养基中添加蚕蛹粉，分析添加蚕蛹粉对蛹虫草菌丝体生长状况，子实体生长情况以及子实体有效成分虫草素、虫草多糖含量的影响。试验结果表明：蚕蛹粉添加量为6 g时，子实体生长状态最佳，畸形率最低、出草率最高、平均高度最高，干品产量最高，达到(5.36±0.087) g·瓶-1；在蚕蛹粉量为8 g时，虫草素与总虫草素的含量最高，分别达到(7.39±0.095) mg·g-1和(34.06±0.164) mg·瓶-1；在蚕蛹粉量为6 g时，虫草多糖及总虫草多糖的含量最高，分别达到(23.26±0.086) mg·g-1和(124.67±0.089) mg·瓶-1。试验结果为蛹虫草产业化栽培及深层开发提供一定的理论依据。

蛹虫草; 蚕蛹粉; 菌丝体; 子实体; 虫草素; 虫草多糖

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)，又名北冬虫夏草，属于真菌门、子囊菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属。经研究表明，蛹虫草含有丰富的生物活性成分，虫草素、虫草酸、虫草多糖等。虫草素是一种核苷类抗生素，具有抗菌、抗病毒、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用，具有中医医理中冬虫夏草一样的阴阳同补和双向调节人体平衡的功能。虫草多糖具有抗癌活性，能对肿瘤起抑制作用，亦可增强机体对各种病菌、病毒、真菌及寄生虫的抵抗力(张平等，2003)。目前冬虫夏草资源逐渐枯竭，蛹虫草由于其有效成分与冬虫夏草相似、甚至高于野生冬虫夏草的特性，已渐渐成为冬虫夏草替代品(高怀安等，1987)。近年来，蛹虫草栽培已进入规模化生产，但仍旧面临着菌种退化、产量下降、质量下降等各种问题。目前关于培养基中添加蚕蛹粉的研究主要集中在对子实体产量及个别活性成分方面的影响，而蛹粉代料培养(申鸿等，2012)更是成本太高，不适用于大规模生产。本试验系统研究添加不同量蚕蛹粉对蛹虫草整个生长过程及子实体主要活性成分的影响，得出高产高质条件下的最适蚕蛹粉添加量，为高产高质量蛹虫草栽培及蛹虫草深层开发提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料及试剂 蛹虫草菌母种，由安发(福建)生物科技有限公司研发中心实验室提供。

葡萄糖、蔗糖购自广东光华化学厂有限公司；琼脂、硫酸镁、维生素B1、蛋白胨、磷酸二氢钾购自天津市福晨化学试剂厂；蚕蛹粉购自西安渔人乐制饵厂；虫草素、甘露醇标样购自大连美仑生物科技有限公司；甲醇(色谱纯)、四氢呋喃(色谱纯)购自武汉思仪科技有限公司；无水乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸、苯酚(分析纯)购自天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.1.2 主要仪器 450 mL的栽培瓶；250 mL的三角瓶；试管；JA1003N电子天平；SW-CJ-1A超净工作台；LDZX-50FB高压灭菌锅；SPX-250BS-Ⅱ生化培养箱；BSD-YX2200摇床；接种枪；TES1330A照度计；MS6508数显温湿度计；Waters高效液相色谱仪；Waters2487紫外检测器；Part No.wato45905C18(4.6 mm×150 mm)色谱柱；汉邦C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱；0.5 μm水相微孔滤膜；恒温水浴锅；722分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基制备 用于菌种分离培养的斜面培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，MgSO40.5 g,KH2PO41.0 g,VB10.1 g，pH自然值。

用于培养菌丝体的液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g,MgSO4 1.0 g,KH2PO42.0 g, VB10.1 g，pH自然值，分装至三角瓶。

用于栽培的培养基：以不添加蚕蛹粉的培养基作为对照(CK)，分别添加蚕蛹粉2、4、6、8、10、12 g，依次为试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。每瓶大米30 g，营养液42 mL(营养液配方：蔗糖20 g，蛋白胨5 g,MgSO41.0 g,KH2PO42.0 g,VB10.1 g,水1 000 mL,pH自然值)。

1.2.2 菌种活化 将蛹虫草母种进行分离接种至斜面试管，放置于生化培养箱中18 ℃下培养，在培养的第4 d开始每天进行10 h光照培养，7 d左右获得生产菌种。

1.2.3 液体菌种制备 在超净工作台下，将试管菌切成小碎块，接种至液体培养基中，温度20 ℃下静置培养24 h，后置于摇床内120 r·min-1下进行振荡培养6 d左右，获得液体接种菌。

1.2.4 接种 超净工作台无菌环境下，将液体菌种稀释5倍，每瓶大米培养基接种5 mL的液体菌种。

1.2.5 后期管理 将接过菌种的培养瓶放置培养室内，温度18 ℃，相对湿度50%-60%条件下进行黑暗培养10 d左右，至菌丝吃透培养基并覆盖了整个培养基；发菌完成后开始进行弱光照培养，光照度200-400 lx，光照时长10 h·d-1，温度20 ℃，相对湿度70%-80%条件下培养6 d左右，至培养基完全转为橙色；转色后即可进行温差处理，刺激原基分化，温差控制在5-8 ℃，其他条件维持不变，培养5 d左右，至有较多小刺尖状突起形成；原基分化后开始进行恒温培养，温度22 ℃，相对湿度80%-90%，光照700-1 000 lx，光照时长12 h·d-1条件下培养35 d左右,采收60 ℃烘干。

1.2.6 有效成分含量测定 将子实体干品磨成粉末，过100目筛，每个试验组取适量用于有效成分的含量测定。

虫草素测定方法参照《中国药典》，采用HPLC法测定虫草素含量(顾振宇等，2007)。

虫草多糖：提取虫草多糖，取每组样品粉末，以无水乙醇提取10 h除去脂溶性成分，自然风干，取脱脂后的残渣，用水浴70 ℃恒温提取2次，过滤，取滤液减压浓缩，浓缩液以Savag法除去蛋白质，最后移入100 mL的容量瓶中，冷却定容备用。葡萄糖标准曲线绘制，精确称取葡萄糖200 mg，置于100 mL容量瓶中，定容摇匀，取1 mL溶液溶于50 mL容量瓶中定容摇匀，备用。分别吸取标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,用蒸馏水补充至2.0 mL，加入6%的苯酚溶液1 mL，静止10 min,摇匀，静置20 min，于490 nm处测定吸光值，以2.0 mL蒸馏水作为空白，得到回归方程：A=0.0089C+0.0117，r=0.995。其中，A为吸光值，C为葡萄糖浓度。含量测定，精密吸取样品处理液1.0 mL，置于10 mL比色管中，加水补足至2.0 mL，样品管和空白管中加入苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加浓硫酸5.0 mL，摇匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出冷却至室温，于490 nm处，以空白校正零点，用1.0 mL比色皿测吸光度(卢晓岩，2002；王蕾等，2003)。

1.2.7 数据统计分析 试验数据经Excel软件处理后，使用SPSS 22.0软件获得平均值及标准误差。对不同处理间的差异进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同蚕蛹粉添加量对菌丝生长的影响

由表1可知，添加蚕蛹粉，菌丝生长状态明显好转，生长速度明显提高。与其他组相比，当添加蚕蛹粉量为6 g和8 g时，菌丝生长状态、菌丝生长速度均相差不大，且明显优于其他组；当添加量继续增多时，菌丝生长状态、生长速度均有下降。试验结果表明，添加蚕蛹粉量在6-8 g时，更有利于菌丝生长。

表1 添加不同量蚕蛹粉对菌丝生长的影响1)

Table 1 Effect of different amount of silkworm pupa powder on growth of mycelium

处理菌丝形态菌丝色泽菌丝密度生长速度/(mm·d-1)CK瘦弱浅白稀疏1.24±0.012cⅠ较健壮白较稀疏2.41±0.035bⅡ较健壮白较稀疏2.68±0.041bⅢ健壮洁白浓密3.72±0.032aⅣ健壮洁白浓密3.86±0.065aⅤ较健壮白较稀疏2.71±0.087bⅥ瘦弱浅白稀疏2.52±0.029b

1)同列数据后不同小写字母表示差异达0.05显著水平。

2.2 不同蚕蛹粉添加量对子实体生长的影响

由表2可知，随着蚕蛹粉添加量的增多，子实体生长状态呈先好转后下降的趋势，在添加量为6 g时，子实体生长状态最佳，畸形率最低、出草率最高、平均高度最高，干品产量最高，达到(5.36±0.087) mg·瓶-1。在添加量达到10 g以上时，出草率明显降低，且低于CK，分析其原因可能是由于蚕蛹粉量过多，培养基黏性太大，从而能影响子座抽生。

表2 添加不同量蚕蛹粉对子实体生长的影响1)

Table 2 Effect of different amount of silkworm pupa powder on growth of sporocarp

处理畸形率/%出草率/%平均高度/cm干品产量/(g·瓶-1)CK39.84±0.066a48.94±0.073bc4.63±0.061c1.87±0.053cⅠ30.13±0.085b70.24±0.093b6.15±0.073b3.27±0.084bⅡ29.86±0.056b71.08±0.053b6.21±0.068b3.40±0.072bⅢ18.25±0.093c98.53±0.071a9.46±0.069a5.36±0.087aⅣ24.17±0.067bc90.16±0.058a9.05±0.082a4.61±0.061abⅤ30.46±0.062b43.87±0.065c7.38±0.063ab3.01±0.073bⅥ30.24±0.074b40.42±0.064c7.17±0.092ab2.96±0.078b

1)同列数据后不同小写字母表示差异达0.05显著水平。

2.3 不同蚕蛹粉添加量对子实体有效成分含量的影响

由表3可知，试验组虫草素、虫草多糖含量均高于CK。随着蚕蛹粉量的增加，虫草素呈先增加后降低的趋势，虫草多糖的含量呈现先增多后减少再增多的趋势。在蚕蛹粉量为8 g时，虫草素与总虫草素的含量最高，分别达到(7.39±0.095) mg·g-1和(34.06±0.164) mg·瓶-1；在蚕蛹粉含量为6 g时，虫草多糖及总虫草多糖的含量最高，分别达到(23.26±0.086) mg·g-1和(124.67±0.089) mg·瓶-1。试验结果表明，添加蚕蛹粉有利于子实体中主要有效成份虫草素及虫草多糖含量的形成积累。

表3 添加不同量蚕蛹粉对子实体有效成分含量的影响1)

Table 3 Effect of different amount of silkworm pupa powder on active principle content of sporocarp

处理虫草素含量/(mg·g-1)总虫草素含量/(mg·瓶-1)虫草多糖含量/(mg·g-1)总虫草多糖含量(mg·瓶-1)CK2.48±0.062d4.64±0.162d11.51±0.064d21.52±0.187dⅠ3.35±0.087cd10.95±0.136c16.49±0.076c53.92±0.173cⅡ4.43±0.075c15.06±0.192bc19.72±0.063b67.05±0.202bcⅢ5.32±0.068b28.51±0.146b23.26±0.086a124.67±0.089aⅣ7.39±0.095a34.06±0.164a17.43±0.073c80.35±0.194bⅤ4.36±0.083c13.12±0.157bc20.64±0.083b62.13±0.132bcⅥ4.07±0.072c12.05±0.203bc20.35±0.092b60.23±0.17bc

1)同列数据后不同小写字母表示差异达0.05显著水平。

3 结论与讨论

蛹虫草栽培过程中充足的营养成份是高质高产的关键性因素之一，而蚕蛹粉因其富含各种营养成份而成为蛹虫草栽培过程中常用的添加物。研究结果表明，随着蚕蛹粉添加量的增多，菌丝体生长状态及生长速度、子实体生长状态及产量均呈先提高后降低的趋势，这可能是由于在蚕蛹粉含量越来越多时，培养基粘度增大，阻碍了其生长，这与叶晶晶等(2013)关于子实体产量研究的结果一致；在蚕蛹粉添加量达到10 g时，出草率甚至低于CK，说明过量的蚕蛹粉对出草的影响较大；添加蚕蛹粉能够明显提高子实体中有效成分的含量，且随着添加量的增多，虫草素含量呈现增加后降低的趋势，虫草多糖呈现先增多后减少又增多的现象，可能是由于虫草素是蛹虫草的一种次级代谢产物，而虫草多糖作为蛹虫草代谢过程中的初级产物是虫草素形成的一种中间产物，具体影响机制还有待研究。

由试验得知，每30 g大米培养中，添加蚕蛹粉6-8 g时，菌丝生长状态最佳，生长速度最快，达到(3.72±0.032)-(3.86±0.065) mm·d-1；添加蚕蛹粉6 g时，子实体产量最高，达到(5.36±0.087) g·瓶-1，虫草多糖含量也最高，达到(124.67±0.089) mg·瓶-1；当蚕蛹添加量为8 g时，子实体中虫草素的含量达到最高值为(34.06±0.164) mg·瓶-1。为规模化生产蛹虫草及其有效成分的开发利用提供一定的技术支撑，本试验所利用蚕蛹粉价格低廉、操作简便，也符合蛹虫草产业化发展的趋势。

卢晓岩,2002.硫酸苯酚法测定北冬虫夏草多糖含量[J].食品工业科技,23(4):69-70.

高怀安,陈世中,王丽荣,等,1987.秦巴蛹虫草与冬虫夏草某些化学成分的对比研究[J].中药通报,12(2):44-45.

顾振宇,吴雪美,张虹,等,2007.高效液相色谱法测定冬虫夏草中虫草素和虫草酸的含量[J].中国食品学报,7(3),144-148.

申鸿,张龙,王兵,等,2012.蚕体和蛹粉代料培养基上的蛹虫草生长状况与品质检测[J].蚕业科学,38(1):130-134.

王蕾,于荣敏,张辉,等,2003.人工培养蛹虫草多糖的分离纯化及其结构的初步研究[J].中国生化药物杂志,24(1):23-25.

叶晶晶,张剑飞,曹宁宁,等,2013.添加蚕蛹粉和改变营养液pH对人工培养蛹虫草子实体产量及虫草素含量的影响.[J].蚕业科学,39(3):624-627.

张平,朱述钧,钱大顺,等,2003.北冬虫夏草功能成分及保健作用分析[J].江苏农业科学,31(6):105-107.

(责任编辑：陈晓雯)

Effect of adding silkworm pupa powder on growth ofCordycepsmilitarisand active principle of sporocarp

LI Fei, WANG Zhong, BIAN Wen-Yin, HUANG Bao-Ju

(Alpha(Fujian)Bio-technologyCo.Ltd.,Ningde,Fujian352100,China)

The effect of silkworm pupa powder (SPP) on growth ofCordycepsmilitarisand active principle (cordycepin and cordyceps polysaccharide) of sporocarp were anlyzed by adding SPP into the rice medium. The results showed that when the SPP amount was added by 6 g, the sporocarp grew best, with lowest deformity rate and highest average height, and the highest yield reached (5.36±0.087) g·bottle-1; while it was added by 8 g, the content of cordycepin and the total cordycepin is highest, reaching (7.39±0.095) mg·g-1and (34.06±0.164) mg·bottle-1respectively; while it was added by 6 g, the content of cordyceps polysaccharide and total cordyceps polysaccharide was highest, reaching (23.26±0.086) mg·g-1and (124.67±0.089) mg·bottle-1respectively. This results would provide a reference for industrialization cultivation and deep development ofC.militaris.

Cordycepsmilitaris; silkworm pupa powder; mycelium; sporocarp; cordycepin; cordyceps polysaccharide

2016-08-23; 发表日期： 2016-10-31

李菲(1991-)，女，本科。研究方向：蛹虫草栽培。Email：lfco313030679@sina.com。

S567.3+5

A

1001-4276-(2016)01-0069-05

李菲,王忠,卞文印,等,2016.添加蚕蛹粉对蛹虫草生长及子实体有效成分的影响[J].武夷科学，32：69-73.