刁非非 赵永峰 姜常青 韩铠怿 谢之景



水貂抗貂细小病毒中和抗体滴度的测定

刁非非①②赵永峰①②姜常青①②韩铠怿①②谢之景①②*

（①山东农业大学动物科技学院 山东泰安 271018 ②山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室 山东泰安）

为了解当前水貂病毒性肠炎疫苗及免疫程序的在水貂的免疫效果，该研究在6个水貂养殖场，随机对MEV疫苗免疫接种后55~60d的水貂进行心脏采血，共采集、制备84份血清。采用血清微量中和试验，测定84份水貂血清中抗MEV的中和抗体滴度。结果表明，抗MEV中和抗体滴度大于10的共10份血清，仅占11.9%，其中1份效价为56，1份效价为28，1份效价为21，6份效价为14，1份效价为12，其余74份水貂血清中的抗MEV中和抗体滴度均小于10，达88.1%。当前水貂MEV疫苗免疫程序的免疫效果很差，是造成在水貂养殖过程中MEV流行的重要因素，因此有必要加强研究制定科学水貂MEV疫苗免疫接种程序。

水貂 貂细小病毒 中和抗体

水貂病毒性肠炎(Mink viral enteritis)又称貂泛白细胞减少症(Mink panleucopenia)或貂传染性肠炎(Mink infectious enteritis)是由貂肠炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)，又称貂细小病毒(Mink parvovirus)，感染引起的一种急性传染病，主要特征为急性出血性肠炎和白细胞减少[1-5]。本病多发生于貂，各种品种和不同年龄的貂都有易感性，但以当年生水貂更易感，而50~60日龄的仔貂最为易感，发病率50%~60%。病貂的年龄越小病死率越高，最高可达90%。病貂、痊愈带毒貂和患泛白细胞减少症的猫是主要传染源。它们从粪、尿、唾液中排毒，通过污染的饮水、饲料、饲具等，经消化道和呼吸道传染给易感健康貂。此外，鸟类、鼠类和昆虫等也可成为传播媒介。本病常呈地方流行性。一旦引入貂场，如没有良好的兽医防疫卫生措施，常常导致长期存在和周期性发生流行。潜伏期4~9d，病貂体温升高到40~40.5℃。减食或拒食，但渴欲明显增加。有的患病貂于12~24h迅速死亡；有的病貂发生急性肠炎，腹泻，粪便稀软，或呈水样，颜色呈粉红色、褐色、灰白色或绿色，粪便含有脱落的肠粘膜、粘液或血液。白细胞明显减少，由正常的9500下降到5000以下。病貂可视黏膜苍白，消瘦、虚弱、脱水，常常伸展四肢平卧，最后衰竭而死，或逐渐恢复健康，长期带毒，生长发育迟缓。病死率因貂的品种和流行情况而异，一般10%~80%，高的可达90%以上。病程12h~14d不等。

所有养水貂的国家均有该病的发生，MEV疫苗的应用在一定程度上控制了MEV的流行。山东省是我国水貂养殖第一大省，在省水貂养殖场经常有MEV感染的病例出现，给养殖户造成很大的经济损失。造成免疫失败的原因较多，但其确切原因尚不清楚，其中疫苗免疫效果不好是造成免疫失败的一个重要原因。目前，有关MEV疫苗免疫接种的效果尚不清楚，为此该研究对水貂血清中抗MEV中和抗体滴度进行了测定，为进一步研究科学的水貂MEV疫苗接种程序提供了实验数据。本研究具有重要的生产实践意义。

1 材料和方法

1.1 毒株与细胞 MEV-SD-1本实验室分离鉴定保存，CRFK细胞由辽宁出入境检验检疫局胡传伟研究员惠赠。

1.2 血清样品 在诸城、东平、文登三地6个水貂养殖场，这6个水貂养殖场均对水貂进行了1次MEV疫苗免疫接种，随机对MEV疫苗免疫接种后55~60d的水貂进行心脏采血，制备血清，共84份，置-20℃冻存，待检。

1.3 中和抗体效价的测定 采用血清微量中和试验测定水貂血清抗MEV中和抗体效价。采用固定病毒—稀释血清法[6]，在96孔微量细胞培养板上进行。首先将血清样品置56℃水浴30min，灭活血清中非特异性病毒抑制成分，随后将血清样品中加入终浓度为0.025%恩诺沙星，10000ｒ/min离心10min，去除可能的细菌污染物。先将血清稀释成1:10，再作2倍连续稀释(共8个稀释度)。随后分别加入等量含100TCID50的病毒悬液。经25℃、2h感作后，分别加入96孔板，每个稀释度加4孔，每孔加100ul。然后将分散并稀释成2.5~3.0×106个/ml的CRFK细胞悬液加入96孔板，每孔加50µl，置5%CO2培养箱内(37℃，60%~80%湿度)培养。同时设血清毒性对照，阴阳性血清对照，病毒对照及正常细胞对照。4d判定结果，以每孔完全不出现细胞肿胀、破碎、脱落的细胞病变作为中和阳性标准，以出现中和阳性的血清最高稀释滴度为中和终点，按Reed-Muench法计算血清的中和抗体效价，以其倒数作为水貂血清中抗MEV中和抗体滴度。

2 结果

在84份水貂血清中，抗MEV中和抗体滴度大于10的共10份血清，仅占11.9%，其中1份效价为56，1份效价为28，1份效价为21，6份效价为14，1份效价为12，其余74份水貂血清中的抗MEV中和抗体滴度均小于10，达88.1%，见附表。这表明水貂血清中抗MEV的中和抗体滴度很低，水貂养殖企业所采用的MEV免疫程序不合理，不能够诱导动物机体产生很好的抗体水平。

附表 水貂抗MEV中和抗体滴度 （%）

地区养殖场只数滴度<10 滴度>10只数 只数比例只数比例 诸城1131292.31(56)7.7 2171588.22(14,12)11.8 3171694.11(21)5.9 东平11512803(14)20 2121083.32(14)16.7 文登1109901(28)10 合计6847488.11011.9

3 讨论

（1）山东省是水貂养殖大省，尽管MEV疫苗的应用在一定程度上控制MEV在水貂的流行，但是近年来，在实际生产过程中仍有许多MEV感染的水貂病例，给本省水貂养殖业造成了很大的经济损失。免疫程序不合理是造成免疫失败的重要原因，但其确切原因尚不清楚。但是疫苗免疫效果不好是造成免疫失败的一个重要原因。中和抗体是抗病毒免疫的主要因素,也是疫苗免疫效果的重要检测指标之一。抗MEV中和抗体对于水貂抵抗MEV的感染是十分重要的。为了了解水貂MEV疫苗的免疫效果，该研究对水貂血清中的抗MEV的中和抗体水平进行了检测。（2）在84份水貂血清中，有74份水貂血清中的抗MEV中和抗体滴度均小于10，高达88.1%，只有10份水貂血清中抗MEV中和抗体滴度大于10，仅占11.9%。这表明水貂养殖企业所采用的MEV免疫程序不合理，不能够诱导动物机体产生很好的抗体水平，这是造成MEV流行的重要因素。为此，应加强水貂MEV疫苗免疫程序的研究，减少因该病造成的经济损失。

[1] Sun JZ, Wang J, Wang S, Yuan D, Birame BM, Li Z, Yi B, Liu W. MicroRNA profile analysis of a feline kidney cell line before and after infection with minkenteritis virus. Gene. 2014, 539(2): 224-9.

[2] Zuo J, Rao J, Xu H, Ma L, Li B, Wang Y, Cai X, Han W, Lei L, Liu B. Analysis of the vp2 gene sequence of a new mutated mink enteritis parvovirus strain in PR China. Virol J. 2010.7:124.

[3] Park GS, Best SM, Bloom ME. Two mink parvoviruses use different cellular receptors for entry into CRFK cells. Virology. 2005, 340(1):1-9.

[4] Uttenthal A, Lund E, Hansen M.Mink enteritis parvovirus. Stability of virus kept under outdoor conditions. APMIS. 1999, 107(3):353-8.

[5] Zhang DL. Studies on isolation, serum-free cultivation and manufacture of mink enteritis virus optimized for vaccine preparation. Biologicals. 1997, 25(1): 103-11.

[6] 扈荣良. 现代动物病毒学第1版[M]. 北京: 中国农业出版社. 2014 (12).

（2016–05–18）

S852.65+9.2

A

1007-1733(2016)09-0001-02

山东省现代农业产业技术体系特种经济动物产业创新团队项目（SDAIT-21-07）。