李兆双，王喜男，王 鹏，陈尚钘，*，范国荣，王宗德

(1.江西农业大学 林学院，国家林业局江西省樟树工程技术研究中心，江西 南昌 330045； 2.江西农业大学 江西特色林木资源培育与利用2011协同创新中心，江西 南昌330045)



天然柠檬醛衍生物对食品腐败细菌的抑制活性

李兆双1，2，王喜男1，2，王 鹏1，2，陈尚钘1，2，*，范国荣1，2，王宗德1，2

(1.江西农业大学 林学院，国家林业局江西省樟树工程技术研究中心，江西 南昌 330045； 2.江西农业大学 江西特色林木资源培育与利用2011协同创新中心，江西 南昌330045)

采用抑菌圈法和琼脂二倍稀释法，测试了12种天然柠檬醛衍生化合物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌的抑菌活性。结果表明，12种天然柠檬醛衍生化合物对4种细菌均有一定的抑菌效果。其中，异丁酸香叶酯对大肠埃希菌抑菌效果最佳，抑菌圈直径为14.83mm，最低抑菌浓度为8mg·L-1；橙花醇对金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌抑制效果最佳，抑菌圈直径分别为15.80和14.33mm，最低抑菌浓度分别为8和16mg·L-1；香叶醇对绿脓杆菌抑制效果最佳，抑菌圈直径为15.00mm，最低抑菌浓度为16mg·L-1。经天然柠檬醛衍生物处理后，食品腐败细菌细胞膜的相对渗透率升高，表明这些化合物可能对细菌细胞膜具有破坏作用。

天然柠檬醛衍生物；食品腐败细菌；抑菌活性

食品是人类赖以生存的基本物质，新鲜的食品是保障人类健康的基本条件。食品中含有丰富的蛋白质、碳水化合物和脂肪类营养物质，易感染一些腐败菌类，造成食品色香味与营养价值等劣化[1]。食品防腐剂可以有效地解决这一问题，延长食品的保质期，使资源得到充分的利用。目前，在食品领域广泛使用的防腐剂仍以化学合成为主，由于其长期与过量使用，带来的环境污染及对健康的危害受到广泛关注。同时，由于食品防腐剂种类的单一，使部分腐败菌类产生了抗性，所以寻找安全、高效、低毒天然的新型食品防腐剂势在必行[2-3]。

山苍子是中国南方特有的樟科植物资源，资源非常丰富，从其果实、枝叶中提取分离的山苍子油，主要成分为柠檬醛等。山苍子油及其柠檬醛具有重要的开发利用价值，被广泛应用于化妆品、食品、香料等行业[4]。研究表明，山苍子油、柠檬醛及其衍生物具有广泛的抑菌活性[5-6]。Onawunmi等[7]发现柠檬醛对革兰氏阳性与革兰氏阴性细菌抗菌活性较强；Saddiq等[8]研究发现，柠檬醛衍生物有较强抗细菌活性。本文开展12种天然柠檬醛衍生物对4种食品腐败菌抑菌活性及机制研究，为筛选高效的植物源杀菌剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

供试样品包括香叶醇、橙花醇、橙花叔醇、四氢香叶醇、乙酸橙花酯、异戊酸香叶酯，异丁酸橙花酯、甲酸香叶酯、丙酸香叶脂、乙酸香叶酯、丁酸香叶酯、异丁酸香叶酯，所有化合物均是江西农业大学植物天然产物与林产化工研究所利用天然柠檬醛、香茅醛为原料，经结构修饰改造而得到，洁尔灭消毒液(Bromo Geramine)购买于江西草珊瑚消毒用品有限公司。以上样品GC纯度均达95%以上。

大肠埃希菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、绿脓杆菌(Pseudomonasareuginosa)由广东省疾病预防控制中心提供。

牛肉膏蛋白胨培养基121℃灭菌30min，备用。

1.1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-ID型无菌超净工作台，苏州净化设备有限公司；GHP-250型智能培养箱，上海三发科学仪器有限公司；DDS-307新电导仪，上海精密科学仪器有限公司；755B紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；牛津杯等。

1.2 试验方法

1.2.1 菌体活化及菌悬液制备

将4种菌接入配置好的牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养24h，待用。取活化好的新鲜菌种，用无菌生理盐水适当稀释，与0.5号麦氏比浊管对比，制备菌悬液浓度约为108cfu·mL-1，备用。

1.2.2 最小抑菌浓度测定

样品溶液的配制。采用二倍稀释法[9]，分别称取化合物于无菌烧杯中(以总体积不超过2%的吐温为助溶剂)，采用容量瓶定容，得到2560mg·L-1的母液，采用二倍稀释法稀释系列浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20mg·L-1的梯度样品溶液。

含药平板的制备。将2mL上述不同浓度梯度的待测溶液分别加入到8个不同的培养皿中，每个待测化合物设8个测试培养皿、1个阳性对照培养皿(加入0.4mL吐温)和1个空白对照(无菌水)，各加入18mL已加热溶解、并在45～50℃水浴平衡的琼脂溶液，混合均匀后，将培养皿水平放置，待琼脂完全凝固后得到浓度稀释为原来的1/10的含药平板，浓度大小依次为256、128、64、32、16、8、4、2mg·L-1，以新洁尔灭作阴性对照。

菌体接种。取100μL菌液均匀涂布于含药培养基，接种后于30℃培养24h，观察细菌生长情况，与对照培养皿比较。

1.2.3 抑菌圈测定

将12种化合物浓度均配制成256mg·L-1(以总体积不超过2%的吐温作为助溶剂)，移液枪取100μL菌液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，每个平板中放置3个牛津杯，各个牛津杯加入同种药液200μL，接种后至30℃培养24h，十字交叉法测抑菌圈直径。新洁尔灭作阴性对照，无菌水作空白对照[10-11]。每组实验重复3次，取平均值。

1.2.4 菌液电导率的测定

根据1.2.2节和1.2.3节筛选出对4种菌抑菌效果最好的化合物。将对数生长期的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌用0.1mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，菌液浓度配制成108cfu·mL-1，选取效果好的化合物与菌液混合配制成最小抑菌的浓度，每隔10min测1次电导率，重复3次[12]。

2 结果与分析

2.1 天然柠檬醛衍生物的抑菌活性

抑菌圈直径的判定标准：抑菌圈直径大于20mm为极度敏感，15～20mm为高度敏感，10～15mm为中度敏感，7～9mm为低度敏感，小于7mm为不敏感[11]。12种化合物对4种细菌都有一定的抑制效果。由图1-A可知，四氢香叶醇、甲酸香叶酯、异丁酸香叶酯对大肠埃希菌抑菌效果高于新洁尔灭，具有较强抑菌效果。从图1-B可以看出，橙花醇、异丁酸橙花酯、甲酸香叶酯对金黄色葡萄球菌的抑制效果均高于新洁尔灭，具有较佳的抑制效果，其中，橙花醇的抑制效果最好。从图1-C可以看出，大多数化合物对绿脓杆菌的抑菌圈直径均为10～15mm，为中度敏感，具有一定的抑制效果，香叶醇的抑菌圈直径为15mm，为高度敏感，抑制效果最佳。从图1-D可以看出，对于表皮葡萄球菌，抑菌圈直径大于新洁尔灭的有橙花醇、四氢香叶醇、乙酸橙花酯及丁酸香叶酯，其中，橙花醇的抑菌效果最佳。

2.2 天然柠檬醛衍生物的最低抑菌浓度

最低抑菌浓度MIC值是测定抑菌物质抑菌活性大小的指标。由表1可知，部分化合物无法测出MIC值，说明其抑菌作用弱。橙花醇、香叶醇、异丁酸香叶酯对4种菌的抑菌作用较强。异丁酸香叶酯对大肠埃希菌的抑菌效果是12种化合物中最强的，其MIC值为8mg·L-1，低于新洁尔灭(32mg·L-1)。橙花醇对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，MIC值最小为8mg·L-1，低于新洁尔灭(16mg·L-1)。香叶醇对绿脓杆菌抑菌效果最强，MIC值为16mg·L-1，与新洁尔灭相当。橙花醇对表皮葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC值最小，为16mg·L-1，与新洁尔灭相当。

A，大肠埃希菌；B，金黄色葡萄球菌；C，绿脓杆菌；D，表皮葡萄球菌A，Escherichia coli; B，Staphylococcus aureus; C，Pseudomonas areuginosa; D，Staphylococcus epidermidis

2.3 天然柠檬醛衍生物对细菌菌体细胞膜通透性的影响

根据抗菌物质干扰细菌代谢过程的不同，可将抑菌机理分为5大类型：抑制细胞壁合成、影响响细胞膜功能、抑制细胞蛋白质合成、作用于能量代谢系统、干扰核酸合成。菌液电导率的变化是反映细菌细胞膜通透性变化的主要指标[12]。前人研究结果表明，高效抑菌剂会破坏细胞膜，使内部的电解质外泄，导致电导率和细胞膜相对渗透率改变。从图2可以看出，天然柠檬醛衍生物处理后的菌液相对渗透率远远高于对照组，说明细胞膜破坏较为严重，可能为天然柠檬醛衍生物抑菌作用的主要原因。

表1 最低抑菌浓度
Table 1 The MIC value

菌种Bacteria化合物Compound不同浓度的抑菌效果Inhibitioneffectofdifferentconcentration(mg·L-1)248163264128256大肠埃希菌香叶醇Geraniol++++++----Escherichiacoli橙花醇Nerol+++++++++--橙花叔醇Nerolidol++++-----四氢香叶醇Tetrahydrogeraniol++++-----乙酸橙花酯Nerylacetate++++++++----异戊酸香叶酯Geranylisovalerate+++++++++---甲酸香叶酯Nerylisobutyrate+++++++---丙酸香叶酯Geranylformate+++++++---乙酸香叶酯Geranylpropinate++++----丁酸香叶酯Geranylacetate+++++---异丁酸香叶酯Geranylbutyrate++------异丁酸橙花酯Geranylisobutyrate++++++----新洁尔灭BromoGeramine++++----金黄色葡萄球菌香叶醇Geraniol+++++++--- Staphylococcusaureus橙花醇Nerol++------橙花叔醇Nerolidol++++++---四氢香叶醇Tetrahydrogeraniol+++++----乙酸橙花酯Nerylacetate+++++-----异戊酸香叶酯Geranylisovalerate+++++++----甲酸香叶酯Nerylisobutyrate+++++++---丙酸香叶酯Geranylformate++++++---乙酸香叶酯Geranylpropinate+++++-----丁酸香叶酯Geranylacetate++++++++++++++异丁酸香叶酯Geranylbutyrate+++++++++--异丁酸橙花酯Geranylisobutyrate+++++-----新洁尔灭BromoGeramine+++-----绿脓杆菌香叶醇Geraniol+++----- Pseudomonasareuginosa橙花醇Nerol+++++++-橙花叔醇Nerolidol++++-----四氢香叶醇Tetrahydrogeraniol++++++---乙酸橙花酯Nerylacetate+++++----异戊酸香叶酯Geranylisovalerate+++++---甲酸香叶酯Nerylisobutyrate++++----丙酸香叶酯Geranylformate+++++++++++++++乙酸香叶酯Geranylpropinate++++++++++++丁酸香叶酯Geranylacetate+++++----异丁酸香叶酯Geranylbutyrate+++++++---异丁酸橙花酯Geranylisobutyrate++++----新洁尔灭BromoGeramine+++-----表皮葡萄球菌香叶醇Geraniol++++++++++ Staphylococcusepider-midis橙花醇Nerol+++-----橙花叔醇Nerolidol++++++--四氢香叶醇Tetrahydrogeraniol++++----乙酸橙花酯Nerylacetate++++++++--异戊酸香叶酯Geranylisovalerate++++++---甲酸香叶酯Nerylisobutyrate+++++----丙酸香叶酯Geranylformate++++++----乙酸香叶酯Geranylpropinate++++----丁酸香叶酯Geranylacetate++++----异丁酸香叶酯Geranylbutyrate++++----异丁酸橙花酯Geranylisobutyrate++++++--新洁尔灭BromoGeramine+++-----

A，大肠埃希菌；B，金黄色葡萄球菌；C，绿脓杆菌；D，表皮葡萄球菌A，Escherichia coli; B，Staphylococcus aureus; C，Pseudomonas areuginosa; D，Staphylococcus epidermidis

3 讨论

采用抑菌圈法和琼脂二倍稀释法，分析了12种天然柠檬醛衍生物对4种食品腐败细菌的抑制效果。结果表明，这些天然产物及其衍生物对供试的革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠埃希菌、绿脓杆菌)均有一定抑菌效果。陈南南等[13]研究表明，过氧化氢和丁二酮对大肠埃希菌抑菌效果较佳，其MIC均为25mg·L-1。本文选取的12种化合物中，异丁酸香叶酯对大肠埃希菌抑菌效果最强，抑菌圈直径为14.83mm，MIC为8mg·L-1，抑菌效果优于过氧化氢和丁二酮；李仲兴等[14]研究表明，连翘对金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球的体外抗菌活性较好，MIC分别为980和244mg·L-1。在本文选取的12中天然柠檬醛衍生物中，橙花醇对金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌抑制效果最佳，对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为15.80mm，MIC为8mg·L-1，对表皮葡萄球菌的抑菌圈直径为14.33mm，MIC为16mg·L-1，其抑菌效果远远高于连翘。香叶醇对绿脓杆菌抑制效果最佳，抑菌圈直径为15.00mm，MIC为16mg·L-1，抑菌效果优于肉桂醛(MIC为26mg·L-1)[15]。异丁酸香叶酯处理大肠埃希菌后，菌液的相对渗透率增大；橙花醇处理金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌、香叶醇处理绿脓杆菌后，菌液的相对渗透率也均增大，造成细胞膜的破坏，推测其抑菌作用的主要原因为破坏细菌的细胞膜。

本文所采用的抑菌化合物是天然柠檬醛等经简单衍生而来的，均为植物源，在耐药性、低毒性和环保性方面具有一定的优势，在食品防腐剂领域值得进一步开发应用。

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(责任编辑 侯春晓)

Antimicrobial activity of natural citral derivatives on food deterioration bacteria

LI Zhao-shuang1，2，WANG Xi-nan1，2，WANG Peng1，2，CHEN Shang-xing1，2，*，FAN Guo-rong1，2，WANG Zong-de1，2

(1.CollegeofForestry，JiangxiAgriculturalUniversity，CamphorTreeEngineeringandTechnologyResearchCenterforStateForestryBureauandJiangxiProvince，Nanchang330045，China; 2.2011CollaborativeInnovationCenterofJiangxiTypicalTreesCultivationandUtilization，JiangxiAgriculturalUniversity，Nanchang330045，China)

The antibacterial activities of 12natural citral derivatives againstEscherichiacoli，Staphylococcusaureus，Staphylococcusepidermidis，Pseudomonasaeruginosawere evaluated through anti-bacterium-circles and two-fold agar dilution methods.The results showed that these citral derivatives all had antibacterial effect on four bacteria.Geranyl isobutyrate exhibited the strongest effect onE.coli，with the diameter of antibacterial circle 14.83mm and MIC 8mg·L-1; Nerol strongest onS.aureusandS.epidermidis，with the diameters of antibacterial circle 15.80and 14.33mm and the MIC 8and 16mg·L-1; Geraniol best onP.aeruginosa，with the diameter of antibacterial circle 15.00mm and MIC 16mg·L-1.The relative permeability of bacterial’s cytomembrane was measured，and the result showed that the relative permeability increased after treated by the citral derivatives，which implied that these citral derivatives had a destructive effect on the bacterial cytomembrane.

natural citral derivatives; food deterioration bacteria; antimicrobial activity

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.19

2016-05-31

国家自然科学基金项目(31360163)；中央财政林业科技推广示范项目(JXTG [2014]-10)；江西省林业科技创新项目(201502)

李兆双(1993—)，男，江西萍乡人，硕士，主要从事林产资源加工研究。E-mail：724059421@qq.com

*通信作者，陈尚钘，E-mail：csxing@126.com

S917.4；Q753

A

1004-1524(2016)11-1928-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1928-1933

http://www.zjnyxb.cn

李兆双，王喜男，王鹏，等.天然柠檬醛衍生物对食品腐败细菌的抑制活性[J].浙江农业学报，2016，28(11): 1928-1933.