杨振东，王加生,,，唐莉莉，孙秀兰，Kathy S. Xue

1. 江南大学 食品学院，无锡 214122 2. 美国佐治亚大学 环境健康科学系，佐治亚雅典 30602



玉米赤霉烯酮暴露导致的秀丽隐杆线虫生殖及发育毒性的世代间比较

杨振东1，王加生1,2,，唐莉莉1，孙秀兰1，Kathy S. Xue2

1. 江南大学 食品学院，无锡 214122 2. 美国佐治亚大学 环境健康科学系，佐治亚雅典 30602

利用模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)对玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)暴露导致的生殖、发育缺陷在世代间的可传递性进行了研究。对亲代染毒，后代断毒恢复，实验结果显示，ZEN暴露导致的体长发育缺陷可在线虫后代中得到恢复，而生殖毒性可产生严重缺陷，且这种缺陷在后代中没有明显的恢复。通过多代持续染毒实验，发现ZEN对亲代P0、子一代F1和子二代F2线虫产生的生殖和发育毒性存在差异，其毒性作用强度为P0 > F2 > F1。线虫世代之间的发育缺陷和生殖缺陷表现出逐代修复的规律，但修复程度不同，推测与线虫自身修复的复杂应激活动有关。

玉米赤霉烯酮；秀丽隐杆线虫；生殖发育毒性；世代可传递性

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又被叫做F-2毒素，是由多种镰刀菌产生的一种非类固醇结构的真菌毒素[1-2]。我国多数地区雨量充沛，玉米、小麦等粮食作物在种植和储存加工时均极易受到霉菌污染，进而产生真菌毒素污染。2013年，季海霞等[3]对我国12省市饲料及饲料原料霉菌毒素污染状况进行了调查，结果表明，ZEN是我国原料和全价饲料中超标率和检出水平最高的真菌毒素之一。国内外大量文献证明，ZEN具有较强类雌激素作用[4]，而且除了对繁殖机能造成影响外，还具有肝毒性、肾毒性、免疫毒性、细胞毒性和遗传毒性，且对肿瘤的发生也有一定影响[5-7]。为控制ZEN对人和动物的危害，目前已有19个国家制定了食物中ZEN的限量标准，欧盟规定精炼玉米油中ZEN不得超过200 μg·kg-1[8]。我国规定人食用的小麦、小麦粉、玉米、玉米面中限量为60 μg·kg-1；饲料用玉米和配合饲料中ZEN限量为500 μg·kg-1。虽然文献对ZEN毒性已经有了很多研究报道，但是由于以往实验物种的局限性，ZEN导致的多种生物学毒性是否可以从暴露当代传递到下一代，其可能机制是什么目前尚不清楚。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)是一种国际公认的模式生物。其结构简单、遗传与发育背景清楚，生长周期短、个体体积小、易于培养，对外界环境的变化非常敏感，在环境胁迫下秀丽线虫会改变它们的生殖速度、生命周期以及其他发育特性[4,9]，非常适合用于特定毒素的相关毒理学评价。另外秀丽线虫可以在土壤中存活，也可以在水中生存，因而被广泛用于土壤[10-11]、水样[12]等环境样本中的外源毒素检测。目前秀丽线虫已经成功应用于重金属[13-14]、有机污染物[15]、药物[16]、纳米材料[17]等毒性评价。这些外源环境污染物不仅可以导致人和动物的急性或者慢性疾病，而且可能诱发毒性从暴露当代传递到后代动物中。秀丽线虫的生活周期通常只有3～4 d，在针对世代间毒性可能传递问题的研究上具有先天优势。现有研究数据已经证明利用秀丽线虫作为模式生物，纳米材料量子点暴露导致的线虫生殖腺和胚胎缺陷可以传递给线虫后代[18]，另外纳米银也被证明暴露导致的毒害缺陷不仅可以传递到F1后代动物，有些甚至可以传递到F2甚至F3代中[19]。

本研究利用线虫生长周期短的特点，采用身体长度和后代数目作为评价指标研究ZEN导致的发育和生殖毒性在线虫暴露当代和后代中的表现，从而分析ZEN毒性在世代间可能存在的可转移性，为ZEN的生态环境安全性提供实验数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试剂与线虫品系

玉米赤霉烯酮购自于Sigma-Aldrich公司，纯度99.9%。玉米赤霉烯酮粉末先高浓度溶解于二甲基亚砜(DMSO，购自Sigma-Aldrich公司，纯度≥99.9%)制备成储备液，然后稀释为实验分析使用的3种浓度溶液，10 mg·L-1、40 mg·L-1和80 mg·L-1。

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)品系为野生型N2和绿色荧光蛋白融合表达dpy-31转基因品系，购买于国际线虫遗传中心(CGC)。绿色荧光基因标记于绿色荧光蛋白融合表达dpy-31转基因品系线虫dpy-31基因片段，伴随虾红素-金属锌蛋白表达，在发育过程的上皮细胞表达强烈，遇到外界刺激时，也可表达于肠道和神经组织[20]。有研究证明dpy-31基因的表达程度与ZEN暴露成浓度依赖关系(数据未给出)。线虫储备培养使用含有大肠杆菌OP50的线虫生长琼脂培养基[21]。线虫测试指标培养使用含OP50的液体培养基L-brot[22]。所有线虫培养均在20 ℃条件下进行。

1.2 暴露方法

秀丽线虫N2被分作2组(Group 1和Group 2)进行培养和指标测定，如图1所示。每组线虫均有1个对照组和3个暴露组。Group 1中除当代线虫(P0)染毒外，后代线虫(F1和F2)均在不含ZEN的L-broth中培养繁殖，而Group 2中，三代线虫均从L2时期进行ZEN暴露。

1.3 体长的测定

将L2期幼虫转移到含有L-broth的细胞培养板中，培养板每孔中为含1 mL特定ZEN浓度(0，10，40，80 mg·L-1)的L-broth溶液。每孔放入100条线虫，暴露72 h，使用10%福尔马林溶液处死线虫，在生物显微镜下观察并拍照。使用Image-Pro®Express software软件测量线虫体长。每个浓度组设3个平行组，每组20条线虫。

1.4 后代数目的测定

将L4期幼虫转移含有L-broth的细胞培养板中，每条线虫1个孔，暴露72 h，使用10%福尔马林溶液处死线虫，在生物显微镜下记录后代数目。

1.5 转基因品系线虫荧光测定

对转基因品系线虫的ZEN暴露处理如1.4描述。线虫暴露72 h后，将活体线虫盛放与载玻片中使用激光共聚焦显微镜(Zeiss-510)观察。

1.6 统计学分析

实验结果均用SPSS 16.0软件进行分析。应用ONEWAY-ANOVA检验方法对数据间进行组间差异显著性分析。P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果以均值和标准差的形式给出，每组实验至少重复3次。

2 结果(Results)

2.1 ZEN暴露导致的发育缺陷可在子代中恢复

通过观察测量线虫的身体长度和形状考察玉米赤霉烯酮对线虫生长发育的影响。亲代线虫P0在玉米赤霉烯酮影响下，处理组成虫体长相较于对照组明显变短，随着ZEN浓度增加，身体长度成线性减短，表现出显著的浓度依赖效应(图2)。在Group 1中的后代线虫F1和F2在没有ZEN暴露下，子一代F1即恢复了正常体长，但是这种身体复原在子二代中依然存在，甚至在子二代中，40 mg·L-1暴露组的F2代线虫体长显著高于对照组，其他2组虽没有显著差距但体长也略高于对照组。并且从身体形状看，亲代染毒ZEN的子代，不但长度会优于对照组，而且身体宽度也明显增加，使暴露组的后代F1、F2看上去比对照组强壮(图4)。

图1 秀丽线虫及其后代多代玉米赤霉烯酮(ZEN)染毒分组培养示意图Fig. 1 Diagram of the steps for the toxicity test with multi-exposures to zearalenone (ZEN) in different generations of C. elegans

图2 Group 1中不同组别ZEN暴露下秀丽线虫及其后代的体长比率对比注：a，b，c组的亲代线虫(P0)ZEN暴露浓度分别为10、40、80 mg·L-1，子代线虫(F1和F2)不染毒。体长比率由暴露组线虫体长与对照组线虫体长比较得到。*P<0.05，**P<0.01。Fig. 2 Comparison of developmental defects in ZEN exposed C. elegans and there offsprings in Group 1Note: The ZEN exposed concentrations in group a, b, c for first generation P0 were 10, 40, 80 mg·L-1 respectively. F1 and F2 were treated without ZEN. The growth rate is obtained by the body length in treated group compared to control group. *P<0.05, **P<0.01.

图3 Group 2中不同浓度ZEN暴露下秀丽线虫及其后代的体长比率对比注：体长比率由暴露组线虫体长与对照组线虫体长比较得到。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig. 3 Comparison of developmental defects in ZEN exposed C. elegans and there offsprings in Group 2Note: The growth rate is obtained by the body length in treated group compared to control group. *P<0.05，**P<0.01, ***P<0.001.

图4 不同ZEN处理下秀丽线虫及其后代的形态对比 (标尺100 μm)注：图A中a，b，c组亲代线虫(P0)ZEN暴露浓度为10, 40, 80 mg·L-1，子代线虫(F1，F2)不染毒。Fig. 4 Comparison of C. elegans morphology in different ZEN groups (Scale bars, 100 μm)Note: The ZEN exposed concentration in group a, b, c for first generation P0 were 10, 40, 80 mg ·L-1 in Fig.A. Fl and F2 were treated without ZEN in Fig.A.

2.2 ZEN暴露可导致线虫子代产生体长发育代偿作用

Group2 中的后代线虫F1和F2继续暴露于同浓度ZEN中，其成虫的身体长度虽然依然比对照组要短小，但其受ZEN的影响已经显著减弱。P0亲代线虫中不同暴露浓度组线虫体长与对照组对比均有显著差距，而F1代线虫中，这种差异减弱，显然后代线虫出现了对ZEN生殖缺陷毒性的抵抗性。但是在F2代线虫中，10 mg·L-1和40 mg·L-1暴露组的线虫反而比第一代线虫体长缺陷更加严重，体宽和体长都明显减少，仅仅80 mg·L-1ZEN暴露组线虫身体长度异变为特别显著地长于对照组(图3和图4)。

2.3 ZEN暴露导致的世代间可传递的生殖缺陷

ZEN暴露可以导致线虫后代数目的明显减少，并且有明显的剂量依赖效应。本实验中，80 mg·L-1暴露组线虫后代数目较之对照组减少可达60%以上(图5)。停止染毒后，线虫的生殖能力缺陷在F1和F2中可见部分恢复，但3个暴露组F1代线虫依然全部表现出明显生殖能力减弱，F2代线虫仍可以表现出缺陷，特别是40 mg·L-1和80 mg·L-1暴露的子二代线虫仍然有显著的生殖能力减弱。这说明ZEN可导致的秀丽线虫产生严重的生殖缺陷并且这种缺陷可传递给下一代。在子代中线虫生殖缺陷仅可以得到部分恢复，高剂量ZEA暴露组的线虫生殖缺陷没有明显恢复。

图5 Group 1中不同组别ZEN暴露下秀丽线虫及其后代的后代数目比率对比注：a，b，c组的亲代线虫(P0)ZEN暴露浓度分别为10、40、80 mg·L-1，子代线虫(F1和F2)不染毒。后代数目比率由暴露组线虫后代数目与对照组线虫后代数目比较得到。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig. 5 Comparison of reproductive defects in ZEN exposed C. elegans and there offsprings in Group 1Note: The ZEN exposed concentrations in group a, b, c for first generation P0 were 10, 40, 80 mg·L-1 respectively. F1 and F2 were treated without ZEN. The brood size rate is obtained by the brood size in treated group compared to control group. *P<0.05，**P<0.01, ***P<0.001.

图6 Group 2中不同浓度ZEN暴露下秀丽线虫及其后代的后代数目比率对比注：后代数目比率由暴露组线虫后代数目与对照组线虫后代数目比较得到。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig. 6 Comparison of reproductive defects in ZEN exposed C. elegans and there offsprings in Group 2Note: The brood size rate is obtained by the brood size in treated group compared to control group. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

2.4 ZEN暴露可使线虫子代产生生殖能力的代偿作用

在Group 2中，F1代线虫的后代数目较之自己的亲代P0都有所增加，虽然依然受ZEN暴露影响后代数目同对照组比较明显减少，但如图6中所示暴露剂量依赖效应已经不明显。F2代线虫对ZEN暴露更加敏感，后代数目较之对照组大幅度减少，并且40 mg·L-1和80 mg·L-1暴露组线虫的剂量依赖性又进一步减弱。值得注意，F2代40 mg·L-1和80 mg·L-1暴露组线虫线虫表现出比亲代更加明显的生殖缺陷，而10 mg·L-1暴露组三代线虫后代数目并没有明显差异。

2.5 转基因品系线虫荧光表达结果

本研究使用绿色荧光蛋白融合表达dpy-31转基因品系线虫，观察线虫对ZEN暴露的应激反应。如图7所示，对照组线虫体内绿色荧光仅表达在胚胎表面，且表达强烈，显示线虫正常活跃的生殖能力。而暴露组线虫，胚胎不但数目减少，绿色荧光强度也随暴露浓度增减而逐渐减弱，显示胚胎发育能力降低，完全没有荧光表达的胚胎可能已经死亡。并且随着暴露浓度增加，肠道和神经组织的绿色荧光表达逐渐强烈，显示线虫已经对ZEN暴露产生了应激反应。

3 讨论(Discussion)

环境毒素暴露所诱发的毒性在世代间可能存在可传递的特性，但是受限于模式动物的生命周期，目前所进行的实验大多基于染毒动物的子一代F1性状进行分析。由于秀丽隐杆线虫的仅仅3 d的生命周期，在秀丽线虫中进行世代传递毒性研究可以在短时间追踪F1后代表现甚至F2、F3后代线虫的表现[19]。本实验利用秀丽线虫的短生命周期，进行多代线虫染毒ZEN实验。Yang等[9]在试验中证明ZEN可以使秀丽线虫产生身体长度缩短、宽度减小的生长缺陷和后代数目减少的生殖缺陷。而对于ZEN生殖毒性的传递性，有研究报道给怀孕母猪口服ZEN染毒，结果显示ZEN可以通过胚胎将毒性传递给子代，从而导致子代生殖功能受损[23]。但是依然缺乏数据证明ZEN生殖发育毒性是否可以在其他物种中进行世代间传递以及调控机制。

线虫的生长发育通常用体长和体宽来评价。体长增长体现发育是否正常，体宽表现出发育快慢。ZEN进入动物体内后，不论ZEN还是其代谢产物都可以通过肝肠循环在体内转运和积累从而继续发挥毒性作用[24]。本实验中，不论低浓度或高浓度ZEN均可对亲代秀丽线虫P0生长产生显著的抑制，P0线虫的体长随ZEN浓度的增加而表现出线性缩短。从图4中也可看出，暴露组线虫的体宽也出现了明显的变窄，说明ZEN阻碍线虫正常生产，延迟发育时间。ZEN可以使线虫体长变异为短细型。但是体长和体宽的缺陷在不染毒的情况下，可以在代际间逐步恢复。暴露组的子代线虫身体发育缺陷在子一代F1即可恢复，子二代甚至出现高剂量组身长高过对照组现象，提示随着ZEN暴露的结束，线虫自身的机体代偿作用可以修复最初的组织损伤从而恢复身体形态。但是这种代偿作用可能会保持并且传递给下一代，并可在ZEN的不断刺激下得到加强(图3)。这种代偿作用在Group 2的多代染毒实验中得到验证：ZEN对Group 2中P0、F1和F2产生的发育毒性存在差异，这种差异并不是表现为逐代恢复，而是毒性作用强度为P0>F2>F1。Group 2中的F1代线虫体长均长于同组P0线虫，说明亲代的代偿作用传递给后代，使子代线虫产生了对ZEN的抗性[25]。在ZEN高浓度80 mg·L-1暴露组，F2代线虫身体长度远远大于对照组，说明代偿作用过度也可能导致发育畸形。这些均说明ZEN可导致线虫的身体发育畸形，线虫对ZEN发育毒性可产生代偿作用，这种代偿作用可在世代间传递并有可能导致致畸性。这种代偿作用同样可以在ZEN对线虫生殖能力的影响中找到(图6)，但是并不明显。后代数目是评价秀丽线虫生殖能力的重要指标。作为一种广为人知的类雌性激素，ZEN暴露可以导致线虫后代数目的显著减少。ZEN对于生殖能力的抑制作用，即使在不染毒的子一代和子二代中依然可以显著存在。这可以解释为虽然线虫自身的代谢补偿使线虫生殖系统组织病理变化得到恢复，但是毒性影响不能消除，即使到F2代，40 mg·L-1组和80 mg·L-1子代线虫生殖能力依然与对照组有显著性差异。比较重要的是不论是体长缺陷还是生殖缺陷，高浓度组的子代线虫比中低浓度组的线虫恢复速度要快，恢复能力要强，说明线虫对ZEN产生的自我修复代偿作用有浓度依赖性。不同于体长缺陷在子一代线虫中即得到显著恢复，生殖缺陷在子二代线虫中依然显著存在。这种对不同毒性的不同敏感性可能是因为秀丽线虫的亚细胞水平以及个体水平等多方面的因素都可导致毒性效应，而不同生物效应产生的复杂性导致毒性评价指标之间存在敏感程度的差异[26]。

图7 绿色荧光蛋白融合表达dpy-31转基因品系标记虾红素-金属锌蛋白在ZEN暴露线虫中的表达(标尺表示50 μm)Fig. 7 Expression of green fluorescent protein in astacin zinc-metalloprotease in ZEN exposed modified gene dpy-31 strain (Scale bars, 50 μm)

停止染毒后，ZEN诱发的生殖缺陷和发育缺陷随着世代的延续逐渐恢复，但是恢复程度不同。ZEN引起的发育缺陷可以在子代中得到部分恢复，生殖缺陷在子代中没有明显恢复。生殖缺陷和发育缺陷在秀丽线虫的后代中恢复程度和恢复速度不同，这种现象一方面可能因为ZEN在亲代和后代中产生的生殖和发育缺陷应激部位和强度不同，另一方面可能是因为暴露的亲代和后代对ZEN的富集和转运存在不同[27-28]。

有数据表明环境毒物所致毒性可以在世代间传递很大程度归因于后代动物的严重应激[29]。ZEN诱发生殖和发育缺陷可以在线虫世代间传递，说明ZEN可以诱发线虫严重应激反应，即身体组织的代偿作用。图7中，不同浓度的ZEN暴露显示线虫产生应激的反应部位和程度不同，这说明线虫对外界刺激的适应响应形成极有可能是基于对于动物应激反应的调控。另外有研究表明环境毒物导致的毒性反应可以在世代间传递，也有可能是由于毒物在暴露目标体内，特别是后代胚胎中的富集导致。对大鼠孕期胎盘转移实验证明，孕鼠口服或者皮下注射ZEN(0.74 mg·kg-1b.w.) 4 h后，可以发现胎鼠中存在有氚标记过的ZEN，但没有明显的聚集区域，这表明孕期摄入ZEN后可以通过胎盘进入胎鼠体内[30]。因此可以推测线虫胚胎在母体中发育过程中已经受到ZEN的影响，对其生殖系统造成危害，毒性效应的传递可能很大程度上是胚胎中ZEN毒性的沉积引起的[24,31]。这种现象在图7中也有表现：ZEN干预会减弱荧光在胚胎中表达。因而由此推断由于这种毒性的沉积传递，身体的应激反应也因此传递给下一代。

总之，ZEN暴露可以引起秀丽隐杆线虫发育和生殖能力的缺陷，并且这种缺陷具有世代间可传递的特性。这也是首次证实了ZEN对于秀丽线虫生殖能力的影响是长期的。但是这种可传递毒性尚不能归于遗传学意义的“遗传”，因为ZEN暴露引起的缺陷仍然可以恢复或部分恢复。这种世代间可传递的机制还需要进一步研究。

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Transgenerational Comparison of Developmental and Reproductive Toxicities in Zearalenone Exposed Caenorhabditis Elegans

Yang Zhendong1, Wang Jia-Sheng1,2,*, Tang Lili1, Sun Xiulan1, Kathy S. Xue2

1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 2. Department of Environmental Health Science, University of Georgia, Athens 30602, USA

Received 29 February 2016 accepted 9 March 2016

This study used model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans) to investigate transgenerational developmental and reproductive toxicities among zearalenone (ZEN)-exposed parents and their progeny. ZEN exposure caused developmental and reproductive toxicities in both parent and progeny C. elegans. The phenotypic defects in un-exposed progeny animals could only be partially or very slightly rescued. Moreover, toxic effects among three exposed generations (P0, F1, and F2) were significantly different with the most severe defects found in F2 progeny, suggesting a successive deterioration or recovery for the transgenerational toxic effects, which may relate to the complex stress reaction resulted from ZEN exposure in C. elegans.

zearalenone; C. elegans; developmental and reproductive toxicities; transgenerational effects

国家自然科学基金联合基金项目(u1301214)

杨振东(1986-)，女，博士，研究方向为真菌毒素毒性检测，E-mail: zdyang777@163.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: jswang@uga.edu

10.7524/AJE.1673-5897.20160229003

2016-02-29 录用日期：2016-03-09

1673-5897(2016)4-061-08

X171.5

A

简介：王加生(1955-)，男，分子流行病学博士，长江学者特聘教授，主要从事生物毒素分子生物标志物研究

杨振东, 王加生, 唐莉莉, 等. 玉米赤霉烯酮暴露导致的秀丽隐杆线虫生殖及发育毒性的世代间比较[J]. 生态毒理学报，2016, 11(4): 61-68

Yang Z D, Wang J S, Tang L L, et al. Transgenerational Comparison of Developmental and Reproductive Toxicities in Zearalenone Exposed Caenorhabditis Elegans [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 61-68 (in Chinese)