孙 荣，欧维正，王 燕，蒙 俊，秦 万，毕雅坤，陈峥宏



贵阳市结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变的检测与分析

孙 荣1，欧维正2，王 燕2，蒙 俊2，秦 万2，毕雅坤1，陈峥宏1

目的 了解贵阳市及周边地区结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因rpsl、rrs和embB的突变特征。方法 对39株结核分枝杆菌临床分离株(乙胺丁醇和链霉素均耐药菌株19株，均敏感菌株20株)的rpsl、rrs和embB基因片段进行PCR扩增和测序，以H37Rv菌株序列为参考，比较耐药菌株和敏感菌株的突变特征。结果 19株耐药菌株中有14株检出rpsl基因突变，突变率为73.7%(14/19)，其中12株为AAG43AGG突变，1株为AAG43AAT突变，1株为AAG88AGG突变；20株敏感菌株中有1株发生rpsl基因AAG43AGG突变，突变率为5.0%；耐药菌株和敏感菌株均未检测出rrs基因突变。19株耐药菌株中有16株检出embB基因突变，突变率为84.2%(16/19)，突变包括6株ATG306GTG突变，ATG306ATA、ATG306ATT和ATG306ATC突变各1株； GGC406GCC和GGC406AGC突变各3株，1株CAG497CGG突变；20株敏感菌株未检测出突变。结论 贵阳地区结核分枝杆菌菌株链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变具有多样性；优势突变分别为rpsl43和embB306位点突变。

结核分枝杆菌；链霉素；乙胺丁醇；耐药性；基因突变

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种传染性疾病，虽然结核病的发病率呈缓慢下降趋势，但是近年来由于耐药结核分枝杆菌的出现和传播，使得结核病的疫情仍然不容乐观。据估算，2013年耐多药肺结核疫情最高的是印度(6.1万)，中国排在第2位(5.4万)，俄罗斯排在第3位(4.1万)。中国新患者中耐多药的比例为5.7%，高于全球平均水平3.5%[1]。中国是人口大国，也是结核病22个高负担国家之一。贵阳市是贵州省的省会，位于中国西南部，属于中国西部地区，经济、医疗、卫生水平处于全国下游，结核病的疫情高于全国平均水平[2]。

合理选择化疗药物、全程足量用药是治疗结核病的关键问题。利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇是治疗结核病的常用一线药物，对这些药物耐药的结核病也是临床上治疗的一大难题。耐药结核病患者需要药物敏感性试验来优化治疗方案。传统的细菌学试验耗时长，不利于结核病的治疗，因此需要研发快速的耐药诊断技术。 目前基因芯片法检测利福平和异烟肼已在临床开展应用，链霉素和乙胺丁醇尚无商品化的快速检测试剂和方法。据报道[3-4]，rpsl、rrs和embB基因的突变分别与链霉素和乙胺丁醇耐药相关，由于结核分枝杆菌耐药基因具有多态性，各地区的流行菌群不同，突变热点也不一致。因此本实验对贵阳市分离的耐药和敏感菌株进行rpsl、rrs和embB基因突变的筛查，为评估和建立本地区结核分枝杆菌的快速诊断耐药性的方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株 质控菌株H37Rv由中国疾病预防控制中心(CDC)传染病所结核病研究室提供，为异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇敏感菌株。39株结核分枝杆菌临床分离株均来自贵阳市肺科医院肺结核患者的痰液标本，根据《结核病诊断细菌学检验规程》进行结核分枝杆菌的分离及鉴定，药物的敏感性实验采用比例法进行[5]，包括乙胺丁醇和链霉素均耐药菌株19株，均敏感株20株。

1.2 主要试剂和仪器 2×Taq PCR Master MIX和DNA Ladder Marker(上海生工生物技术有限公司)；柱式分枝杆菌基因组DNA提取试剂盒(北京天恩泽生物技术有限公司)；生物安全柜由贵阳市公共卫生救治中心分枝杆菌实验室提供，PCR仪由贵州省高校病原生物学特色重点实验室提供。

1.3 结核分枝杆菌基因组DNA的制备 挑取一定量L-J培养基斜面上生长的结核分枝杆菌，置于400 μL TE缓冲液中，混匀后80 ℃水浴灭活15 min，采用柱式分枝杆菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，-20 ℃保存备用。

1.4 PCR扩增和测序 在GenBank中查询标准菌株H37Rv的rpsl(Gene：888259)、rrs(2700429)和embB(886126)基因的全序列，根据文献[6]设计引物(由上海生工生物技术有限公司合成)，详见表1。PCR产物送上海生物工程有限公司进行测序，对于发生突变的菌株均进行两次PCR和测序，确保所得序列的正确性。

1.5 DNA序列分析 将临床分离株测序所得序列在NCBI中进行BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并与GenBank中结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的rpsl、rrs和embB基因序列进行比对，寻找突变位点。

表1 目的基因，引物序列及扩增产物大小
Tab.1 Target gene, primer sequences and product sizes

PrimerSequences(5'→3')Productsize/bprpslF:GCCGAGCTCAAACAGAACGT-GAAAG486R:GTTAAGCTTCGTAGACCGGG-TCGTTGrrsF:ACGGTAGGTGGAGAAGAAG160R:CCCGCACGCTCACAGTembBF:TTAGATACTTCACCCTGACCG-ACGC847R:CAACTTACGGTGAACAGGCA-TAGCG

2 结 果

2.1 链霉素相关耐药基因检测结果 39株MTB临床分离菌株经rpsl基因片段引物扩增后均得到长度约为486 bp的产物(见图1)。将各临床菌株的rpsl基因片段测序结果与GenBank中结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的rpsl基因序列进行比对，19株耐药菌株中有14株存在rpsl基因突变，突变率为73.7%(14/19)，其中12株为AAG→AGG突变，1株为AAG43AAT突变，1株AAG88AGG密码子突变，20株敏感菌株有1株发生rpslAAG43AGG突变，变异率为5.0%；rpsl43突变在链霉素耐药菌株和敏感菌株中的分布差异具有显著性(χ2=17.03，P<0.05)。39株MTB临床分离菌株经rrs基因片段引物扩增后均得到长度约为160 bp的产物(见图2)，但均未检测到rrs基因突变。

M: 100 bp DNA marker; 1: H37Rv; 3-10: Sample; 2: Negative control图1 部分菌株rpsl基因PCR扩增产物电泳图谱Fig.1 Electrophoresis of the amplified PCR products of rpsl

M: 100 bp DNA marker; 1: H37Rv; 3-10: Sample; 2: Negative control图2 部分菌株rrs基因PCR扩增产物电泳图谱Fig.2 Electrophoresis of the amplified PCR products of rrs

2.2 乙胺丁醇相关耐药基因检测结果 对39株

MTB临床分离菌株的embB基因片段进行引物扩增后，均得到长度为847 bp的产物(见图3)。将临床分离株的embB基因扩增产物测序后与GenBank中结核分枝杆菌标准株H37Rv的embB基因进行比对，19株耐药菌株中有9株检出embB基因突变，47.4%(9/19)为306位密码子突变，其中6株为ATG→GTG突变，1株为ATG→ATA突变，1株为ATG→ATT突变，1株为ATG→ATC突变。有7株发生embB基因406及497位密码子突变，3株为406位密码子GGC→GCC突变，3株为406位密码子GGC→AGC突变，1株CAG→CGG(Gln→Arg)突变，embB306突变在乙胺丁醇耐药菌株和敏感菌株中的分布差异具有统计学意义(χ2=12.32，P<0.05)。20株敏感菌株未检测出突变。

M: 100 bp DNA marker; 1: H37Rv; 3-10: Sample; 2: Negative control图3 部分菌株embB基因PCR扩增产物电泳图谱Fig.3 Electrophoresis of the amplified PCR products of embB

表2 结核分枝杆菌临床分离株基因变异分布
Tab.2 Gene mutations in M. tuberculosis clinical isolates

PrimerLocusSequencesAminoacidsequencesVarianceofresistantstainsVarianceofsensitivestainsrpsl43AAG→AGGK→R12143AAG→AATK→N1088AAG→AGGK→R10embB306ATG→GTGM→V60ATG→ATAM→I10ATG→ATTM→I10ATG→ATCM→I10406GGC→GCCG→A30GGC→AGCG→S30497CAG→CGGG→R10

3 讨 论

作为一线抗结核药物，异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素在结核病的防治、治疗方面起着重要作用。随着分子生物的不断发展，经文献报道的，与一线药物耐药相关的耐药基因有十多种。其中与异烟肼耐药相关的katG[7]、inhA[8]及oxyR-aphC[9]基因，与利福平耐药相关的rpoB[10]基因，与链霉素耐药相关的rpsl、rrs基因及与乙胺丁醇耐药相关的embB基因一直是学者们研究较多的内容，目前关于贵州省结核分枝杆菌耐药基因多态性方面的研究较少。本课题组曾对贵阳及周边地区结核分枝杆菌的异烟肼和利福平耐药的特征进行了研究[11-13]，为基因芯片技术快速诊断利福平和异烟肼耐药的推广提供了实验依据。本文对结核分枝杆菌临床菌株进行了链霉素和乙胺丁醇主要耐药相关基因序列的检测和分析，可为研发和推广应用分子生物学技术快速诊断耐药结核提供实验依据。

结核分枝杆菌链霉素耐药是由于编码核糖体S12蛋白的rpsl基因和编码16S rRNA的rrs基因发生突变所致。rpsl基因最常见K43R位突变，少数见K43N位突变[14]。在本次研究的19株链霉素耐药菌株中有14株检测出rpsl43基因突变，其中13株为K43R，1株为K43N突变，也与之前的研究结果一致。在新加坡、东印度[15-16]等地区rpsl43位也是链霉素耐药基因突变的主要变异类型。本次实验中1株链霉素敏感株检出了rpsl43位突变，虽然rpsl43位突变与链霉素耐药性具有统计学意义，但是敏感株发生的突变，降低了rpsl43用于检测链霉素耐药性的特异度。rrs基因的突变主要集中在491位C→T，512位C→T，516位C→T，在530高度保守的环区还可发生513位A-C/T的颠换[17]，但本实验链霉素敏感和耐药株均未检出rrs基因变异，可能是该基因本身突变率较低或者该突变株非本地流行菌群。

乙胺丁醇主要作用于阿拉伯糖基转移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影响细胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物的形成，使药物与酶的相互作用发生改变，导致耐药。embB基因(特别第306位密码子)的错义突变最常见[18]，embB基因突变使糖基转移酶结构发生改变，影响了乙胺丁醇与其相互作用，从而导致结核分枝杆菌对乙胺丁醇耐药性的产生。结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因突变主要发生在306位密码子，变异类型多为M306V, M306I, M306L[19]，这与本次实验结果一致。本实验的19株乙胺丁醇耐药菌株embB基因突变率为84.2%，9株为306位密码子突变，尚存在G406A，G406S和G497R突变，未发现其他地区菌株存在的embB基因285、330和630位点突变[20]，并且有3株乙胺丁醇耐药株未检出embB基因变异。结果表明结核分枝杆菌embB基因突变特征存在地区差异，并且除embB基因突变外，本地结核分枝杆菌对乙胺丁醇可能有其他耐药机制。

本研究通过对结核分枝杆菌临床分离株的基因测序分析发现，各耐药基因突变位点与国内外的研究基本一致，但各位点突变形式和比例又有自身特点。鉴于MTB基因具有丰富的地域多态性，为最大限度地避免假阴性结果，以基因芯片法检测耐药突变和在某地区的广泛应用还需要以大量的临床菌株进行验证。

[1] World Health Organization(WHO): Global Tuberculosis Report[R], Geneva:WHO press.2014.

[2] Wang LX, Cheng SM, Chen MT, et al. The fifth national tuberculosis epidemiological survey in 2010[J]. Chin J Antitube rculosis, 2012, 34(8): 485-508. (in Chinese)

王黎霞, 成诗明, 陈明亭, 等. 2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J]. 中国防痨杂志, 2012, 34(8):485-508.

[3] Cuevas-Córdoba B, Cuellar-Sánchez A, Pasissi-Crivelli A, et al.rrsandrpslmutations in streptomycin-resistant isolates ofMycobacteriumtuberculosisfrom Mexico[J]. J Microbiol Immunol Infect. 2013, 46(1): 30-34. DOI: 10.1016/j.jmii.2012.08.020

[4] Sirgel FA, Warren RM, Streicher EM, et al.EmbB306 mutations as molecular indicators to predict ethambutol susceptibilit y inMycobacteriumtuberculosis[J]. Chemotherapy, 2012, 58(5): 358-363.DOI:10.1159/000343474

[5] Canetti G, Fox W, Khomenko A, et al. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity, and the use of se nsitivity tests in tuberculosis control programmes[J]. Bull World Health Organ, 1969, 41(1): 21-43.

[6] Wang Y, Xie JP, Hu CH，et al. Molecular epidemiological research and rapid detection of streptomycin-resistant gene in drug-resist antMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Infect, 2006, 6(5): 313-316. (in Chinese)

王莹, 谢建平, 胡昌华等. 耐药结核分枝杆菌链霉素耐药基因的分子流行病学研究及其快速检测 [J]. 中国感染与化疗杂志, 2006, 6 (5): 313-316.

[7] Loots du T. An alteredMycobacteriumtuberculosismetabolome induced bykatGmutations resulting in isoniazid resistan ce[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(4): 2144-2149. DOI:10.1128/AAC.02344-13

[8] Tseng ST, Tai CH, Li CR, et al. The mutations ofkatGandinhAgenes of isoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisis olates in Taiwan[J]. J Microbiol Immunol Infect, 2015, 48(3): 249-255. DOI: 10.1016/j.jmii.2013.08.018

[9] Dalla Costa ER, Ribeiro MO, Silva MS, et al. Correlations of mutations inkatG,oxyR-ahpCandinhAgenes andinvitrosusceptibility inMycobacteriumtuberculosisclinical strains segregated by spoligotype families from tuberculosis prevalent cou ntries in South America[J]. BMC Microbiol, 2009, 9: 39. DOI: 10.1186/1471-2180-9-39

[10] Xu G, Wang J, Guo Y, et al. Analysis of the molecular evolution of theMycobacteriumtuberculosisdrug-resistant gene rpoB in Asia using a Bayesian evolutionary method[J]. Clin Lab, 2015, 61(8): 1017-1025.

[11] Bi YK, Ou WZ, Luo KW, et al. Isoniazid resistance and related gene mutation of 31Mycobacteriumtuberculosisclinical isolates in Guiyang area[J]. Chin J Pathogen, 2014, 9(10): 885-887.DOI： (in Chinese)

毕雅坤, 欧维正, 骆科文，等. 31株结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因检测及序列分析[J]. 中国病原生物学杂志, 2014, 9(10): 885-887.

[12] Ou WZ, Chen ZH, Chen J, et al. Determination of resistance geneskatGandinhAinMycobacteriumtuberculosisisola tes from Guizhou Province by gene chip[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 9(10): 885-887. DOI：(in Chinese)

欧维正, 陈峥宏, 陈静, 等. 基因芯片技术检测贵州省结核分枝杆菌耐药基因katG和inhA[J]. 中国人兽共患病学报, 2015, 31 (7): 655-658.

[13] Ou WZ, Luo KW, Chen ZH, et al. Analysis of characteristic ofropBgene mutations associated withMycobacteriumtuberculosisresistance to rifampicin in Guizhou of China[J]. Chin J Clin Pharmacol, 2015, 31(10): 833-835.DOI： (in Chinese)

欧维正, 骆科文, 陈峥宏, 等. 贵州地区结核分枝杆菌利福平耐药相关基因ropB突变特征分析[J]. 中国临床药理学杂志, 2015, 31(10): 833-835.

[14] Shi R, Zhang J, Li C, et al. Detection of streptomycin resistance inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from C hina as determined by denaturing HPLC analysis and DNA sequencing[J]. Mic Infect, 2007, 9(14/15): 153 8-1544.

[15] Sun YJ, Luo JT, Wong SY, et al. Analysis ofrpslandrrsmutations in Beijing and non-Beijing streptomycin-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Singapore[J]. Clin Mic Infect, 2010, 16(3): 287-289.DOI: 10.1111/j.1469-0691

[16] Potdar P, Thakur P. Development of sequence based molecular diagnostic test to evaluate MDR and XDR inM.tuberculosispatients from Western India[J]. Am J Infect Dis Microbiol, 2013, 1(3): 50-58.

[17] Meier A, Sander P, Schaper KJ, et al. Correlation of molecular resistance mechanisms and phenotypic resistance levels in streptomycin-resistantMycobacteriumtuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1996, 40(11): 2452-2454.

[18] Ramaswamy S, Amin AG, Goksel S, et al. Molecular genetic analysis of nucleotide polymorphisms associated with etha mbutol resistance in human isolates ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Antimicrob Anents Chemother, 2000, 44(2): 321.

[19] Zhang H, Chen X, Wang Z, et al. Pyrosequencing analysis for mutations in embB codon306 among clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates from Qingdao, China[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(7): 11276-11282

[20] Zhao LL, Sun Q, Liu HC, et al. Analysis ofembCABmutations associated with ethambutol resistance in multidrug-resist antMycobacteriumtuberculosisisolates from China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(4): 2045-2050.DOI: 10.1128/ AAC.04933-14

Chen Zheng-hong, Email: chenzhenghong@gmc.edu.cn

Detection of mutations associated with streptomycin and ethambutol resistance inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates

SUN Rong1, OU Wei-zheng2, WANG Yan2, MENG Jun2,QING Wan2,BI Ya-kun1, CHEN Zheng-hong1

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China;2.GuiyangPublicHealthCenter,Guiyang550003,China)

Therpsl,rrsandembBgene fragments ofM.tuberculosisisolates collected throughout Guiyang were PCR-amplified and screened for mutations by direct sequencing methodology. These strains included 19 resistant strains resistant to both streptomycin and ethambutol, and 20 strains susceptible to both streptomycin and ethambutol. Results showed that 73.7% (14/19) resistantM.tuberculosisisolates had mutations in therpslgene, and therpslAAG43AGG substitution predominated (85.7%). One isolate had mutations in therpslAAG43AAT, one in therpslAAG88AGG. TherpslAAG43AGG substitution was also found in one susceptible strain, and mutation rate was 5.0% in 20 susceptible strains. No mutations in therrsgene were found in both resistant and susceptible strains. Of 84.2%(16/19) resistant isolates had mutations in theembBgene, includingembBATG306GTG substitution in 6 strains, ATG306ATT, ATG306ATC and CAG497CGG in 3 strains respectively. Three strains harboured theembBGGC406GCC substitution and 3 had GGC406AGC mutation. No mutation ofembBfragment was determined in all the 20 susceptible strains. The results showed diversity in therpslandembBmutations related with streptomycin or ethambutol inM.tuberculosisin Guiyang. Therpsl43 andembB306 are the predominant mutation loci.

Mycobacteriumtuberculosis; streptomycin; ethambutol; antibiotic resistance; gene mutation

陈峥宏，Email: chenzhenghong@gmc.edu.cn

1.贵州医科大学微生物学教研室，贵阳 550025；

2.贵阳市公共卫生救治中心，贵阳 550003

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.015

R378

A

1002-2694(2016)08-0760-05

2016-01-22；

2016-03-18

贵州省社会发展攻关项目(黔科合SY[2013]3060号)；贵阳市科技计划项目(筑科合同[20141001]33号)联合资助

Supported by the Brainstorm Project on Social Development in Guizhou Province (Guizhou Science Contract No.[2013]3060) and the Science and Technology Project in Guiyang City (Guiyang Science Contract No.[20141001]33)