张 姝,罗昭逊,莫 非，何 芸，孙朝琴,张婉颖,曹玉巧，张 岚



头花蓼对幽门螺杆菌粘附定植的影响

张 姝1,罗昭逊2,莫 非1，何 芸1，孙朝琴2,张婉颖1,曹玉巧1，张 岚1

目的 观察头花蓼水提物对幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)粘附定植的影响。方法 采用尿素酶活性比色法定量检测头花蓼水提物作用前后幽门螺杆菌尿素酶活性的影响；运用半固体布氏琼脂平板法检测不同浓度头花蓼对幽门螺杆菌鞭毛运动的影响；利用细胞爬片革兰染色观察不同浓度头花蓼作用后幽门螺杆菌在GES-1细胞表面粘附的变化并计算各组抑制率；采用Real-time PCR 技术检测头花蓼作用前后相关基因ureB、ureE、ureF、flaA、flaB、babA、alpA、alpB的mRNA转录水平。结果 头花蓼水提物对幽门螺杆菌尿素酶活性具有抑制作用，抑制率为44.90±0.289。头花蓼浓度为1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC分别作用后幽门螺杆菌菌膜晕圈直径显著小于对照组, 分别为(5.67±0.55)mm ,(8.5±0.50)mm ,(11.67±1.53)mm,差异有统计学意义(P<0.05)；不同浓度头花蓼水提物均能抑制细菌粘附胃上皮细胞，各浓度组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。头花蓼作用后，与对照组比较，下调了尿素酶结构基因ureB，尿素酶活性基因ureE、ureF、鞭毛相关基因flaB、flaA以及粘附素基因babA、alpA、alpBmRNA的转录水平，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 头花蓼对幽门螺杆菌具有明显的抑制作用，是通过抑制幽门螺杆菌尿素酶活性，减缓幽门螺杆菌的鞭毛动力，影响幽门螺杆菌对胃粘膜上皮细胞的粘附等方面发挥其抑菌作用。

幽门螺杆菌；头花蓼；尿素酶；鞭毛；粘附；

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)的发现革命性改变很多胃肠疾病的基本理论，根除幽门螺杆菌治疗广泛应用于这些疾病的防治。幽门螺杆菌呈螺旋形，有鞭毛、适应性酶和粘附素，这使它能在胃腔不利的酸性环境中定植和生存[1]。因此，成功定植于胃粘膜细胞是整个致病过程中前提和关键，粘附定植的过程可作为我们根治幽门螺杆菌感染研究的一个新的靶点。参与整个定植和生存的因素包括：尿素酶的活性[2-3]、鞭毛动力[4-5]以及粘附性影响[1]。

本课题组在前期的研究中发现头花蓼水提物在体外对幽门螺杆菌具有良好的抑菌活性[6],同时发现其作用可减少幽门螺杆菌在小鼠胃粘膜上的定植密度，但具体的机制尚不清楚。因此，本研究在前期研究的基础上，在体外观察头花蓼水提物作用对幽门螺杆菌尿素酶活性和鞭毛动力的影响；并以人永生化胃上皮细胞GES-1为靶细胞，通过细胞爬片实验观察不同浓度头花蓼水提物对幽门螺杆菌粘附胃粘膜上皮细胞的粘附能力的影响；Real-time PCR检测头花蓼水提物作用前后粘附定植相关因子基因的mRNA转录水平，探讨头花蓼水提物抑制幽门螺杆菌成功定植的作用机制，为头花蓼的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 幽门螺杆菌ATCC700392国际标准测序株，购自ATCC(美国菌种保藏中心)，由本课题组保管。

1.1.2 实验药材 水提苗药头花蓼浸膏粉，棕色粉末，批号为20010401，由浙江众益药业有限公司提供。1.1.3 试剂 布氏肉汤干粉、哥伦比亚血琼脂粉、脑心浸液粉，Oxoid；触酶、氧化酶、尿素酶购自于梅里埃；细菌活性蛋白提取试剂盒及尿素酶活性定量检测试剂盒；RNA反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

1.2.1.1 固体培养平板的制备按说明书方法，称取哥伦比亚血琼脂粉3.9 g，加入84 mL去离子水溶解，高压灭菌(121 ℃，20 min)，待琼脂冷却至56 ℃左右加入无菌脱纤维绵羊血10 mL，混抗1 mL，实验组分别加入5 mL浓度为40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL头花蓼药液，使其平板浓度分别为1/2MIC(2 mg/mL)、1/4MIC(1 mg/mL)、1/8MIC(0.5 mg/mL)，对照组加无菌去离子水，充分混匀后倾倒于直径为90 mm的无菌平皿中，培养基厚度约为3～4 mm。

1.2.1.2 半固体琼脂平板的制备 称取布氏肉汤干粉1.405 g，哥伦比亚琼脂粉0.45 g于锥形瓶中，加入去离子水44.5 mL溶解，此为对照组；实验组则是加入39.5 mL水溶解。高压灭菌(121 ℃，20 min)处理。待琼脂冷却至56 ℃左右时加入无菌脱纤维绵羊血5 mL，混抗0.5 mL，实验组需再分别加入5 mL浓度为40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL头花蓼液，使其平板浓度分别为4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL充分混匀后倾倒于直径为90 mm的无菌平皿中，培养基厚度约为3 mm～4 mm，使其成为含10%脱纤维羊血的布氏肉汤半固体培养基。

1.2.2 尿素酶蛋白活性的检测 刮取对数生长期幽门螺杆菌于脑心浸液肉汤中制备成浓度为1～9×108cfu/mL菌悬液，无菌棉签涂布于空白平皿及含2 mg/mL头花蓼药平皿上，置于微需氧环境中37 ℃培养72 h，同样操作传代于新的平皿，共培养3代后，分别取100 mg于预冷的无菌PBS中。5 000 g离心5 min收集菌体，根据试剂盒说明提取总蛋白。BCA法测定蛋白质含量。参照Rokita E推荐的方法，根据GENMED细菌尿素酶活性比色法定量检测试剂盒检测幽门螺杆菌的尿素酶活性。尿素酶活性的抑制率=(对照组-实验组)/对照组100%

1.2.3 细菌鞭毛动力定量检测 收集培养48 h生长状态良好的幽门螺杆菌悬于脑心浸液，调整菌液浓度至3×108CFU/L。菌液保存在4 ℃备用。取10 μL分别穿刺接种于实验组(含头花蓼药液)和对照组(含等量无菌去离子水)的布氏肉汤半固体琼脂血平板上，相同浓度的各接种2个，置于37 ℃培养箱中培养5 d。分别测量实验组和对照组含药培养基上幽门螺杆菌菌膜晕圈的直径(直尺量其直径)。

1.2.4 头花蓼水提物对幽门螺杆菌粘附GES-1细胞粘附抑制实验

1.2.4.1 菌液的制备 刮取对数生长期幽门螺杆菌，对照组：用不含双抗细胞完全培养基调节菌液浓度为2×106cfu/mL，药物组：分别用含药浓度为128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL的无双抗细胞完全培养基溶液调节菌液浓度为2×106cfu/mL。

1.2.4.2 细胞的培养 从-80 ℃液氮罐中取出冻存管，迅速置于37 ℃水浴箱，轻轻摇动使其尽快融化。用一次性吸管吸取细胞悬液，注入预加有6 mL细胞培养基的离心管中，混合后，1 000 rpm/min，离心5 min，去除上清。将细胞接种于5 mL10% DMEM完全培养基中，置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养。观察细胞的形态。

1.2.4.3 爬片实验观察细胞的粘附 按照文献方法[7-8]，采用对数生长期的GES-1细胞，PBS洗涤细胞3次，胰酶消化，离心收集细胞，用不含双抗细胞完全培养基调节细胞浓度至2×104个/mL，加入到放置有无菌盖玻片的6孔板中，每孔2 mL，在37 ℃细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，用PBS洗涤两次，实验组分别加入含头花蓼浓度为128 μg/ mL、64 μg/ mL、32 μg/ mL、16 μg/ mL细胞培养基配制的2×106cfu/mL的菌悬液2 mL，对照组加入不含药物培养基配制的幽门螺杆菌菌悬液2 mL(设每个浓度做5个复孔)，放入37 ℃细胞培养箱中继续培养2 h后，取出用PBS洗涤3次，取出盖玻片，自然干燥、甲醇固定15 min，PBS漂洗一次，以便漂掉盖玻片上未粘附幽门螺杆菌，然后用革兰染色，油镜下观察计数每个细胞上粘附的细菌数，每组计数30个细胞。计算每个细胞粘附细菌平均数，分析并计算抑制率。抑制率=(对照组-实验组)/对照组100%。实验重复3次。

1.2.5 实时荧光定量PCR 检测幽门螺杆菌粘附定植相关基因表达水平

1.2.5.1 幽门螺杆菌总RNA提取 在头花蓼水提物终浓度为2 mg/mL平板上培养至48 h后的幽门螺杆菌ATCC 700392设为实验组，同批未经头花蓼处理的幽门螺杆菌ATCC 700392为对照组。将对照组与实验组标本用脑心浸液肉汤调试细菌悬液至1～9×107CFU/mL，采用Trizol法提取各组样品的总RNA。

1.2.5.2 实时荧光定量PCR：将各组的幽门螺杆菌RNA按照TaKaRa试剂盒说明书分别进行反转录cDNA后，以其为模板,以16SrRNA基因作为内参,运用SYBR ○R Premix Ex TaqTMII试剂盒在ROCHE Light Cycler480荧光定量PCR仪上检测鞭毛相关基因flaA、flaB,尿素酶活性基因ureE、ureF及粘附素基因babA、alpA、alpB引物设计采用的Primer Primer 5.0软件。相关基因引物序列见表1。引物委托上海生工公司合成。25 μL PCR反应体系：目的基因的上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ(2X) 12.5 μL, RNase Free ddH2O 8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.5 μL。反应条件为: 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每一个样品3个技术重复，每组做3个生物重复。每次PCR反应均设置阴性对照(ddH2O代替cDNA 模板)。采用比较2-△△CT法，对目标基因进行相对定量分析。

表1 PCR引物序列
Tab.1 Primers sequence of PCR

基因名称(Gene)引物序列(5'to3')(Primersequence)产物长度(bp)(Productlength)16SrRNA-FCCGCCTACGCGCTCTTTAC10016SrRNA-RCTAACGAATAAGCACCGGCTAACflaA-FATTGGCGTGTTAGCAGAAGTGA99flaA-RTGACTGGACCGCCACATCflaB-FACATCATTGTGAGCGGTGTGA95flaB-RGCCCCTAACCGCTCTCAAATbabA-FTGCTCAGGGCAAGGGAATAA95babA-RATCGTGGTGGTTACGCTTTTGalpA-FGCACGATCGGTAGCCAGACT90alpA-RACACATTCCCCGCATTCAAGalpB-FACGCTAAGAAACAGCCCTCAAC82alpB-RTCATGCGTAACCCCACATCAureFFGGGGCTTGTGGATAGCATAA206ureFRCGCATTCTTTTGGGCTAGAAureEFTCTTGGCTTGGATGTGAATG185ureERGGAATGGTTTGAAACGAGGAureBFGGTCCTGCTGATGGCACTA236ureBRGCGTCGTTAGAAGCGTTACG

3 结 果

3.1 头花蓼水提物对细菌尿素酶活性的影响 采用尿素酶活性比色法检测实验组和对照组的尿素酶活性，显示头花蓼作用后幽门螺杆菌尿素酶活性与对照组相比显著降低，为184.78 mIU/min±4.74 mIU/min，差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组与对照组的尿素酶活性抑制率为44.90±0.289。见图1。

图1 头花蓼对幽门螺杆菌尿素酶活性的影响Fig.1 Effect of P. capitatum on H. pylori urease activity

3.2 苗药头花蓼作用对幽门螺杆菌鞭毛动力的影响 幽门螺杆菌在半固体培养基上培养5 d后，测量结果显示1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC头花蓼作用后幽门螺杆菌菌膜晕圈直径显著小于对照组, 差异有统计学意义(P<0.05)。药物浓度的越大，幽门螺杆菌菌膜晕圈直径越小。表明苗药头花蓼可降低幽门螺杆菌鞭毛动力，且幽门螺杆菌鞭毛动力的抑制程度与苗药头花蓼药物浓度呈剂量相关性。见表2。

表2 头花蓼作用前后幽门螺杆菌菌膜圈直径的变化
Tab.2 Primers sequence of PCR

组别Group菌膜圈直径(mm)Bacterialcirclediameter对照组16.00±1.001/8MIC组11.67±1.53*1/4MIC组8.50±0.50*1/2MIC组5.67±0.55*

*与空白组相比P<0.05

3.3 不同头花蓼药物浓度对细菌粘附的影响 各药物浓度作用下，细菌对细胞的粘附情况见图2。A图为GES-1细胞在低倍镜下的正常形态。油镜下，对照组可见幽门螺杆菌局灶性粘附GES-1细胞的一侧，呈现趋向性。不同浓度(16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL)头花蓼对幽门螺杆菌粘附GES-1细胞均有抑制作用，细胞上粘附的细菌数均显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。粘附细菌数量随着药物浓度的增加而减少，在128 μg/mL头花蓼组粘附的细菌数量最少。粘附呈弥漫性粘附，无规则地粘附在GES-1细胞表面。见表3。

注：A细胞爬片革兰染色(×100)； B对照组(×1 000)；C为16 μg/mL头花蓼处理组(×1 000) ；D为32 μg/mL头花蓼处理组(×1 000)；E为64 μg/mL头花蓼处理组(×1 000)；F为128 μg/mL头花蓼处理组(×1 000)A：Cell slide Gram stain(×100)，B: The control group A: experimental group(×1 000)，C：The 16 μg/mL P. capitatum group(×1 000)，D：The 32 μg/mL P. capitatum group；(×1 000)，E：The 64 μg/mL P. capitatum group(×1 000)，F：The 128 μg/mL P. capitatum group(×1 000)图2 不同头花蓼浓度对幽门螺杆菌粘附的影响Fig.2 Effect of different concentration of P. capitatum on H. pylori adhesion to cells

表3 不同头花蓼药物浓度对细菌粘附的影响
Tab.3 Effect of different concentration of P. capitatum on H. pylori adhesion to cells

头花蓼浓度P.capitatumconcentration对照组Thecontrolgroup16μg/mL32μg/mL64μg/mL128μg/mL粘附细菌数/个Numberofadherentbacteria58.5±4.5534.50±4.55*26.40±2.81*18.37±3.88*13.4±1.90*抑制率Inhibitionrate—0.410.550.690.77

*P<0.05vs control group

3.4 头花蓼作用对定植相关基因转录水平的影响 以16SrRNA 基因作为内参，采用2-ΔΔCT法对头花蓼对幽门螺杆菌作用后对定植相关基因表达差异进行分析。在头花蓼作用幽门螺杆菌前后，尿素酶基因ureB、ureE、ureF，鞭毛相关基因flaA、flaB，粘附素基因babA、alpA、alpB均有表达，其中对照组与实验组相比其表达量有显著差异(P<0.05)，且对照组>实验组。其中babA基因变化下调最为明显，为17.3倍。见图4。

图4 头花蓼对幽门螺杆菌粘附定植相关基因mRNA转录的影响Fig.4 Effect of P. capitatum on Transcription of genes related to H. pylori colonization

4 讨 论

幽门螺杆菌的致病机制包括诸多环节，其中定植是致病的关键，而粘附是定植的前提，幽门螺杆菌之所以能够在胃肠蠕动是不会与食物一起驱除的原因是幽门螺杆菌的动力比其他菌种强，这使幽门螺杆菌能够快速穿过胃腔的酸性环境达到中性的粘液层中，并穿过粘稠的粘液层，定植与胃黏膜上，幽门螺杆菌可产生大量的尿素酶，约占菌体总蛋白的10%[9]。尿素酶是幽门螺杆菌产生的一种能将尿素水解为氨和二氧化碳的酶，在菌体周围形成“氨云”，使pH值升高引起的低酸可降低黏液中黏蛋白的含量，破坏黏液的离子完整性，削弱胃黏膜屏障功能，使细菌能够顺利穿过胃黏液层到达胃黏膜表面[10-11]。他对于幽门螺杆菌的定植和生存起着重要的作用。抗溃疡药物依卡倍特可通过抑制幽门螺杆菌的尿素酶活性抑制幽门螺杆菌定植而达到辅助治疗幽门螺杆菌慢性胃炎等消化性疾病[12]。幽门螺杆菌尿素酶基因族共包含九个基因，其中ureE、ureF为尿素酶活性基因，他们一起为尿素酶的活性表达所必须[13]。本研究采用比色法检测实验组与对照组的尿素酶活性，观察到在头花蓼的作用下，尿素酶活性降低。同时检测幽门螺杆菌尿素酶活性蛋白基因ureE、ureFmRNA水平与平行培养的对照组相比分别下调3.77倍和5.09倍。因此推测苗药头花蓼除了通过抑制尿素酶活性降低其催化效率外，还通过影响尿素酶基因的转录，降低幽门螺杆菌尿素酶的生成量降低幽门螺杆菌对尿素酶的催化效率，进而降低幽门螺杆菌在胃的生存能力。

当幽门螺杆菌进入胃后，在尿素酶提供的微环境前提下，鞭毛的摆动使细菌作旋转前进，穿透覆盖于胃粘膜上皮细胞的粘液层。故认为鞭毛的动力可直接影响菌株在宿主的定植及生存能力。菌株动力性与其在宿主的感染率成正比，动力极强的菌株感染率可达100%,无鞭毛菌株或鞭毛突变株则不能成功定植于胃黏膜。幽门螺杆菌的鞭毛蛋白由2个鞭毛素基因falA和flaB编码的FalA、FlaB蛋白多聚体组成。这两种鞭毛蛋白对于细菌的运动均是必须的。本研究中，幽门螺杆菌含苗药头花蓼水提取的半固体琼脂平板上的游泳运动能力明显小于对照组，说明其可降低细菌的游泳动力。荧光定量PCR检测结果显示头花廖可显著下调flaA、flaB基因的表达。推测苗药头花蓼作用可能通过影响幽门螺杆菌鞭毛相关基因falA、flaB影响其编码FalA、FlaB鞭毛蛋白的从而抑制幽门螺杆菌的运动能力。

在尿素酶提供的微环境和鞭毛提供动力下，幽门螺杆菌顺利到达相对中性的胃粘膜表面，此时幽门螺杆菌通过粘附素特异性的直接与宿主细胞、粘蛋白等结合使幽门螺杆菌能在宿主体内长期生存。幽门螺杆菌这种特异性的粘附反映了它存在粘附因子，其中最为重要是BabA，AlpA和AlpB。BabA是血型抗原结合性粘附素，介导幽门螺杆菌的初始粘附[14]。AlpA和AlpB由高度同源的基因alpA和alpB编码，alpA、alpB主要与宿主的黏连蛋白层结合介导细菌与胃粘膜组织的粘附，当alpA和alpB缺失情况下，可以减少幽门螺杆菌在动物的定植量[15]在体外细胞爬片实验中观察，头花蓼作用后幽门螺杆菌对GES-1细胞的粘附数量减少，表明头花蓼可以抑制幽门螺杆菌对GES-1细胞的粘附。荧光定量PCR检测头花蓼作用前后粘附素BabA、AlpA、AlpB的基因水平，头花蓼作用后粘附素BabA、AlpA、AlpB的mRNA水平均下调，差异均具有统计学意义。推测当苗药头花蓼作用通过抑制babA基因表达影响幽门螺杆菌表面粘附素BabA的生成量，由BabA介导的细菌初始粘附能力降低。同时等位基因编码的alpA、alpB粘附素基因表达同样受到抑制，alpA、alpB的抑制可降低细菌在胃粘膜的定植量。

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Luo Zhaoxun,Email：2860330236@qq.com

Influence ofPolygonumcapitatumon the adherency and colonization ofHelicobacterpylori

ZHANG Shu1,LUO Zhao-xun2,MO Fei1,HE Yun1,SUN Chao-qin2,ZHANG Wan-ying1,CAO Yu-qiao1,ZHANG Lan1

(1.BiochemistryAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversityGuiyang550004,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

We aimed to observe the influence ofP.capitatumon adherency and colonization ofH.pylori. Urease active colorimetric method would be adopted to quantitatively detect the influence on urease activity ofH.pyloribefore and after the function ofP.capitatum; semi-solid Brucella agar plate method would be used to detect the influence on flagellar movement ofH.pyloribefore and after the function ofP.capitatum; Gram’s stain of cell slides would be utilized to observe the changes of different concentrations ofP.capitatumandH.pylorion the bacteria adhered on the surface of GES-1 cells and calculate the inhibition ratio of all groups; real-time PCR technologies would be adopted to detect the expression level of related genes ofureE,ureF,flaA,flab,babA,alpAandalpBbefore and after the function ofP.capitatum.P.capitatumhad inhibition effect on urease activity ofH.pyloriwith the inhibition ratio being 44.90±0.289. The concentration ofP.capitatumwas respectively 1/2MIC, 1/4MIC and 1/8MIC; after respective function, the diameter ofH.pyloripellicle halo was significantly smaller than that of the control group, respectively (5.67±0.55) mm, (8.5±0.50) mm and (11.67±1.53) mm with statistical difference (P<0.05); different concentrations ofP.capitatumcould all inhibit the bacteria to adhere to gastric epithelial cells and compared to the control groups, all concentration groups were with statistical difference (P<0.05). After the function ofP.capitatum, compared to the control group, the expression level of urease active genesureEandureF, flagellin genes flab and flaA as well as adhesion genesbabA,alpAandalpBmRNA was reduced with statistical difference (P<0.05). It came to the conclusion thatP.capitatumhas obvious inhibition effect onH.pylori, which exerts its antibacterial effect via inhibiting urease activity ofH.pylori, slowing down the flagella movement ofH.pyloriand impacting the adherence ofH.pylorito gastric epithelial cells.

Helicobacterpylori,Polygonumcapitatum,ureases,flagella；adherence

2014年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目(No.201410660014)和2014年贵州省大学生创新创业训练计划项目(No.201410660014)联合资助

罗昭逊，Email：2860330236@qq.com

1.贵州医科大学临床检验教研室，贵阳 550004；

2.贵州医科大学附属医院检验科，贵阳 550004

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.010

R378

A

1002-2694(2016)08-0734-07

2016-02-21；

2016-04-20

贵州省科技合作计划基金(No.黔科合LH(2015)7417号)；贵州省卫生计生委科学技术基金(No.gzwjkj2015-1-003)

Supported by the Special Funds for the Joint Fund from the Scientific and Technological Cooperation Plan Fund in Guizhou (No.Qian Scientific Cooperation LH (2015) 7417),the Joint Fund from the Science and Technology Fund at Sanitation and Family Planning Commission in Guizhou (No.gzwjkj2015-1-003),the Joint Fund from the Science and Technology Plan Project in Guiyang (Construction Scientific Cooperation [No.20141001]);the Joint Fund from the,National University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program in local universities in 2014 (No.201410660014)the Joint Fund from the University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program in Local Universities in 2014 (No.201410660014)