生物电催化系统在健康领域的应用及发展趋势

2016-11-30

传感器世界 2016年11期

合肥工业大学信息工程系，安徽宣城 242000

一、前言

生物电催化系统基于生物实体，其催化涉及化学变化和电能之间相互作用的电化学过程。生物催化装置或与酶、完整细胞、部分细胞或与组织相关，可用于不同用途，如发电、生物修复、化学合成和生物传感，尤其是在生物传感中的应用，更是取得了商业（年营业额可高达130亿美元）和学术双丰收。

生物传感器是一门集微电子学、材料科学、物理化学和生物技术等诸多学科于一身的交叉学科。目前传感器类型以电化学传感器为主，在临床诊断、食品分析、环境监测等领域应用前景广阔。虽然与国际研究有一定差距，但国内在该领域的研究也发展迅猛，近十年平均每年约有600篇相关论文在国内期刊发表，应用范围包括食品农药残留、兽药残留、重金属污染、生物毒素（尤其是黄曲霉素）、环境监测和人体健康等[1-4]。

随着社会的进步和发展形势，人们越来越关注自身的健康，相关费用也占很高比例。根据世界卫生组织（WHO）统计，美国卫生保健支出占其GDP 18%以上，在欧洲占9.5%。所以目前国内、外主要集中在生物传感用于健康监测方面的研究，因为它有助于大大降低医疗成本，提高人们的生活质量。

本综述聚焦于生物电催化系统在健康监测中的生物传感应用，主要讨论过去十年用于健康监测的生物催化系统发展趋势和主要成就。

二、生物传感器中的生物催化剂

在生物传感器中，生物催化是指生物识别元件，通过化学相互作用并转化为可检测的电信号来识别目标分析物。虽然各种识别元件已用于构建生物传感器，但酶是最早的而且还是目前最常用于生物传感的识别元件[5]。电化学生物传感主要使用的是一种特定酶类，如氧化还原酶和氧化酶。由于酶的生物识别简单、成本相对较低，使得酶促生物电催化系统在复杂基质（如生物体液和环境样品）分析中几乎是不可或缺的，因此它们在健康应用中极其重要，如果考虑到糖尿病的多发和葡萄糖氧化酶出色的催化特性，血液葡萄糖生物传感器约占世界市场份额的85%就不足为奇了[6]。然而酶也有一些缺点，如生产和提纯工艺复杂、寿命短以及由于酶的高度专一性导致其很难用于多组分分析物的分析。

微生物细胞是可用于生物传感的另一类生物催化剂，其催化作用是由细胞内的酶来实现的。1911年首次报道了全细胞生物电催化作用[7]，但一直到1975年才将其应用于生物传感器，这种生物传感器基于应用带有氧电极的木醋杆菌。因为信号生成类似于酶促生物催化反应，微生物生物传感器的发展代表了酶电极概念的扩展。

本质上，应用微生物细胞、部分细胞或组织的生物催化系统可以考虑为“酶包”[8]。全细胞的使用可以克服酶促生物电催化的一些不足之处，使用全细胞不要求酶的纯化，可使生物催化系统更加稳定，而且允许使用单个生物催化元件进行多个分析物的检测。然而与酶相比也有不足，如需要提供细胞营养和能量，信号生成速度慢以及缺乏特异性。当然最后一点是微生物生物催化剂的优点，也是它的不足，这主要取决于其用途。例如当需要检测海洋毒素或重金属时[9,10]，使用全细胞就有其优越性；但当进行复杂基质中的葡萄糖或乳酸检测时[11,12]，毫无疑问使用酶更加有效。

生物电催化系统依赖生物催化剂和电极之间的电化学接触。酶促生物电催化有可能间接通过电活性媒介，或者通过生物催化剂活性部位和电极之间的直接电子转移（Direct electron transfer，DET），或者通过介导电子转移（Mediated electron transfer，MET）即人为将小分子引入系统，在酶和电极之间穿梭电子。全细胞利用相似机制完成电子转移，DET是通过细胞外膜的细胞色素或通过特定的生物纳米结构来完成的[13,14]，而MET则是利用生物合成的氧化还原介质（如黄素类、吩嗪和醌类）或化学的外缘介质[15,16]。因为传感器的生物和物理部分之间的电化学接触会直接影响其分析性能，所以在设计用于生物传感的新型生物催化系统时，要特别加以关注。

三、生物传感器的发展趋势

目前人们大多是在医院进行健康监测的，下一步是希望把生物传感器用于家里、口袋里或手腕上来进行相关监测，其核心是在基因、蛋白和代谢水平上，快速、方便和容易测量人们身体的化学物质、身体与周围环境的互相作用以及人们的食物，这就要求下一代相关产品尽量小型化及完全集成平台，如全印刷生物传感器、集成采样和穿戴式装置等。

1、小型化

小型化是生物传感器技术中一个最显著的趋势，具有许多优点，如低成本批量生产、易于存储和销售、改善分析性能、可能制造多分析物的生物传感器等。目前基于电化学转换机制、阵列和芯片技术的进步，使相关生物传感器大大小型化。

（1）基于电化学转换机制的生物传感器

在所有小型化生物传感器系统中，基于电化学转换机制的产品是最成功的，考虑到成本效益、构建和操作的便携性和简单性，使其成为最有希望的发展方向。电化学生物传感装置包含一个电化学单元，通常由两电极或三电极系统构成，其中至少一个电极作为生物识别元件，一个作为电化学检测器。电极很容易小型到微米或纳米级别。电化学检测器和控制仪表也能通过使用微加工和微细加工技术有效降低尺寸[17-19]。

（2）基于微电极阵列的生物传感器

微电极阵列（Microelectrode array，MEA）包括单独寻址电极或连接电极，连接电极的制造技术简单，但单独寻址电极用于生物传感器工艺更加具有优势，如高空间分辨率和可能用于多分析物的检测。

首个基于MEA的生物传感器于1994年问世，葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）等通过光刻固化于沉积在铂阵列上的聚吡咯薄膜，在优化条件下监测所有三个传感器的电流响应。现有类似的固化酪氨酸酶的MEA生物传感器可同时用于监测环境中的多巴胺和儿茶酚，提高了敏感性和特异性。将心肌细胞培养在自组装单层修饰的纳米铂电镀MEA上，制备的便携式8通道无线MEA系统对自然环境监测，以及在海洋毒素、石房蛤毒素、短裸甲藻毒素等浓度增加的情况下，对心肌细胞电活动进行无创监测，根据波尖幅度、发射率和50%尖峰电位持续时间等信号参数变化，进行定量评价和毒理学风险评估[20]。

（3）基于微带电极阵列的生物传感器

微带电极阵列通常用于制作叉指阵列(Interdigital array，IDA)式生物传感器。IDA 包含两对工作电极，表示平行导电材料和交叉隔离的绝缘材料。其工作原理是在两个电极上施加不同电压，循环的氧化-还原产物的电催化反应会导致电流信号放大。同MEA相比，IDA主要优势在于其较低的检出限。

Pavinatto等报道了一个金制IDA，直接在塑料基底上喷墨印刷制作柔性和全打印阻抗生物传感器，采用面积大、产出高的凹版印刷法将含有酪氨酸酶的活性层沉积在印刷结构上，用于葡萄酒和橄榄油中的多酚类物质检测。特别注意的是优化印刷条件以实现沉积小于100μm电极以及开发含酶油墨凹版印刷技术[21]。

丝网印刷作为生产低成本电化学装置的一个标准技术也适用于制造小型化的生物传感器，因为丝网印刷最小的尺寸大约为50～100μm，不足以制造微电极，因此，在创建微带结构时使用了交叉切割技术。Hart研究小组制造了微带葡萄糖生物传感器，采用丝网印刷含有氧化还原介质和GOx的水基碳油墨，然后加绝缘层，将这种结构垂直切割露出20μm厚、3mm长工作电极的边缘。该传感器适用于连续加工-监测，在葡萄糖消耗等情况下，通过切割有可能使自动生物传感器恢复[22]。

（4）芯片实验室

将生物电催化系统与微流体相结合用于研发小型化的集成在一个芯片上的实验室装置，是生物传感器技术一个新出现的领域。

Itoh等证明了一种便携式的、基于液滴的微流体装置可用于鱼新鲜度的现场电化学测定，标记物为5'-三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate, ATP），固定在微电极Na fi on层的双酶系统用于测量ATP浓度。在识别过程中，甘油首先由甘油激酶磷酸化形成甘油-3-磷酸，然后甘油-3-磷酸由磷酸氧化酶氧化，产生过氧化氢，从电流测定上来定量。该装置的检测结果与传统高效液相色谱法的有良好的相关性[23]（见图1）。

Matharu等研发了一种含有包埋辣根过氧化物酶的水凝胶微结构的生物传感器，用于检测乙醇和抗氧化剂对肝细胞的影响，通过产生炎症信号（如细胞因子和活性氧等），在对乙醇毒性触发响应中起关键作用。将 MEA 集成到一个微流体装置上并以胶原蛋白修饰，可以促进肝细胞的粘附性，肝细胞暴露于乙醇和过氧化氢气氛中，然后通过循环伏安法监测4h以上。加入乙醇之前将抗氧化剂和肝细胞一同培养，导致过氧化氢水平下降5倍，说明该生物传感器可用于监测氧化应激，因此可用于研究抗氧化剂的效果[24]。

未来由于微技术发展，有望进一步降低小型化电化学生物传感器的成本和大小，可以使用诸如聚合物和纳米材料等新材料来制造微结构。

不同领域研究成果的汇聚可能给生物传感器技术更多的新方向。例如“智能尘埃”概念的延伸[25,26]，涉及到毫米级别分布式电子元件网络，可以感知环境并在环境和使用者之间进行通讯。

另外一个快速发展趋势是智能手机技术和紧凑型电化学生物传感器的结合[27]，所形成的产品有望促进远程诊断和检测的更多应用，特别是在缺乏足够医疗资源和实验室设备的发展中国家。例如AgaMatrix首次将商用电流型葡萄糖传感器与手机实现了交互，并于2011年12月7日获得了美国食品和药物管理局510(k)许可，随后由制药巨头赛诺菲(Sano fi Aventis)公司在2012年以 iBGStar app的方式上市。然而直到今天，大多数研究还只是将手机当作基于光传导机制的图像设备来应用，未来希望在用于电化学生物传感器的智能手机平台与RFID和近场传输系统的创新性适应性上取得进展。

尽管小型化生物电催化系统发展迅速，但具有高空间分辨率的微米和纳米结构上的生物识别元件的固定仍然是一个难题，对于多分析物装置来说尤其需要在传感器电极和生物元件之间提供有效的电子转移。另外一个难题是由电极大幅度减小到纳米级别所带来的，如批量运输有限、基线漂移相关的噪声问题以及在制造过程中需要更加先进和昂贵设备。通常人们更关注小型化产品所具有的明显优势，而对上述问题有所忽略。使用微米传感器而不是纳米传感器是一个比较好的折中办法。为了进一步改善微米传感器的分析性能并减小分析探针体积，开发具有连续流的微米生物传感器，而不是减小电极尺寸，将是一个好的解决办法，因此未来将会有更多微流体与电化学生物传感器结合的机会。

2、纸质设备

由于份量轻、价格便宜、环境友好、易印刷包装、生物兼容及可一次性使用等特点，纸作为即时检验（point-of-care, POC）设备的诱人材料又出现在人们面前。基于纸质的分析设备有潜力将生物传感器技术引入发展中国家的医疗诊断中，因为它们更符合世界卫生组织有关发展中国家医疗诊断的“放心”理念：可负担、敏感、特异、使用方便、快速和自动、不需其他设备、可交付终端用户等。

纸质形式的比色检测和横向分析是一种很成熟的技术，如用于尿液葡萄糖检验和女性孕检。尽管这种裸眼可视化检测操作简便、价格低廉，但对高灵敏度日益增长的需求，特别是健康应用中数据的传输等，对此检测方法提出了挑战，这促进了纸质设备检测技术与仪器检测技术的结合，如手机比色检测、荧光、化学发光和电化学[28]。除了上述小型化电化学检测的优点外，纸质装置还有对周围光、照明和串色不敏感以及与纸印刷技术高度兼容等优点[29]。

自1995年Medisense (Abbott)公司生产第一只商用电化学葡萄糖传感器以来，电化学纸质分析装置(Electrochemical paper-based analytical device，EPAD)中的生物电催化系统已用于多种健康应用。将纸基平台与电化学检测结合主要有两种策略：一种是使用印刷技术直接在纸质上制作电极或通过溅射沉积金属制作电极[30-32]；另一种是将含有固化生物识别系统的纸片安放在常规电极上（通常是丝网印刷电极[33]）。EPAD中微流体通道的制作常使用光刻、蜡印、浸蜡和蜡染等工艺，进而形成电化学微流体纸质分析装置（Electrochemical microfluidic paper-based analytical device, EμPAD）。

Noiphung等介绍了一种结合血浆的纸片，放在丝网印刷碳电极上，用来检测全血样品中的葡萄糖，这种纸片呈哑铃形，分成两个区域——血浆分离区和浸蜡法形成GOx修饰的检测区[34]。

Henry研究小组首次尝试将微电极引入EμPAD，通过填孔制作微电极，采用激光雕刻技术，用碳糊制成聚酯薄片。为了保证电接触，使肜“三明治”型双电极配置中将工作电极与银丝网印刷纸相结合[35]。

Whitesides研究小组证明了整合EμPAD与商用血糖仪的可能性。在色谱纸上制备EμPAD，由蜡染形成微流体通道，使用安培法测定用于分析人体血浆中的葡萄糖、胆固醇和乳酸以及水溶液中的乙醇。分析所需化学试剂或储存在EμPAD检测区，或与分析物混合储存在单独试管中。这种集成型装置比商用测试条的精确度低，但进一步改进后可用于较便宜的POC设备[36]（见图2）。

Beni等首次证实了全集成混合印刷电子（Hybrid printing electronics, Hy-PE）纸质装置用于电流测量的可行性，该方法将技术较为成熟与先进的电化学生物传感器与以简单制造技术生产的一次性设备集成起来，在常温即可完成此类系统的制作。仪器中集成了丝网印刷的二氧化锰电池与垂直电致变色显示器。显示器类似纸，以反射模式工作，没有背光照亮像素。这种集成生物传感平台可用于不同诊断系统，如电流式酶电极、电化学亲和性分析和一般电解分析[37]。

纸质分析装置在POC诊断和资源有限的条件下可提供性价比较高的解决方案。然而纸基装置缺乏坚固性通常导致其在实际的应用中性能不足。这主要有两个不稳定的原因，第一个是需要更为有效的方法固定生物识别元件以便在生物传感元件和电极之间保持快速电子转移；第二个是温度和湿度对微流体通道中液体流动力的影响而导致信号变化的问题。此外低灵敏度是纸质装置的另一个缺点，最近有研究人员尝试在EμPAD中结合纳米材料和微电极来增加敏感性，中空通道EμPAD的进一步开发有望扩大可分析物的范围[38,39]。

在POC诊断和监测中对于价格低廉的集成平台的需求，将进一步促使价格便宜操作简单的便携式电化学阅读器、纸质装置、能量存储装置、晶体管和其他有源元件等的开发取得突破。自供电生物传感器或太阳能电池与EμPAD结合将会降低成本，提高集成式纸质装置的敏感性[28,29]，生物分析与现代电通信结合是未来POC装置的一个新主题。

3、穿戴式生物传感器

过去十年有关穿戴式生物传感器的开发已吸引了许多关注，其逐渐普及也反应了健康监测的主要趋势，即从基于医院的专业护理系统转向基于家庭的个人医学。在用于心率、血压、体表温度、身体运动等人体参数的监测上，穿戴式物理传感器的开发已取得了很大进步[40]。然而用于监测化学信息的穿戴式无创生物传感器仍处于早期开发阶段，造成这种情况的原因有多种，比如难以获得合适的样本、低浓度分析物的检测存在困难、样品量少、生物传感器存在污损及兼容性问题等等[41]。

穿戴式电化学生物催化传感器的体外监测，可用于眼泪、唾液、汗液和皮肤组织液中的分析物监测[41]。Parviz与合作者首次将GOx固定在隐形眼镜上用于葡萄糖监测，通过在聚合物基底上构建微结构来制作葡萄糖生物传感器，然后再塑型为隐形眼镜[42]。也有研究团队将生物催化识别元件整合进类似于纹身的电化学装置中，实时检测人在自行车运动期间汗液中的乳酸浓度[43]（见图3）。

实现完全穿戴式生物传感器的主要障碍是为传感器和电子电路元件寻找合适的电源。基于酶和微生物的生物燃料电池（Biofuel cell，BFC）可利用穿戴者自身的能源，有望成为穿戴式生物传感器的电源供给。

Sekretaryova等介绍了基于单一酶的自供电生物传感器的概念。例如，在检测全血浆中游离胆固醇时，阳极和阴极都设在碳布电极上溶胶-凝胶中固化的胆固醇氧化酶，介导的生物催化胆固醇氧化为阳极反应，产生的过氧化氢的电催化还原作为阴极反应[44]。

Jönsson-Niedziolka等制作了集成式自供电生物传感器，BFC包括碳纳米材料修饰的氧化铟锡阳极，以及垂直排列的碳纳米管或碳纳米颗粒用于基于抗坏血酸氧化和胆红素氧化酶的呼吸式阴极[45]。

电化学传感器为穿戴式生物传感器用于身体和环境监测提供了许多优势，因为它们能很容易小型化，执行小体积样品的高灵敏度分析，并可与纺织材料甚至直接与皮肤整合。

尽管在穿戴式生物传感器开发上取得了显著进展，但在制造功能化、实时、集成监测装置上仍有很多难题需要攻克。比如如何在穿戴期间保留生物识别系统的生物催化活性，如何将柔性生物电子与生物传感器元件相结合。还有一个以前很少提及而现在越来越引起注意的研究方向——将电化学传感器、电子器件、电源和无线传输系统集成进小型化装置。最后一个是寻找无创分析中体液样本不同分析物浓度与病人健康状况之间的联系。

进一步开发完全自动化、易穿戴的穿戴式传感器，要求印刷和柔性电子技术的提高，如人体传感器网络中的化学传感器与电子皮肤的集成。直接从穿戴者身体的生物体液中获得电能似乎是研究完全集成式穿戴生物传感器的一个可行的方法，如基于BFC的自供电传感器和逻辑门自供电生物传感器等。另外无创性电化学生物传感器也是个人健康监测系统中非常重要的。进而针对移动医疗，将具有直接传输数据到手机、平板电脑或局域网的无线系统与传感设备集成，是生物传感技术中新兴的领域。