于丽娟，张艳花，徐新明，吴伟伟，阿米尼古丽，玛尔孜娅，拉扎提，田可川

（新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830011）

利用PCR技术鉴定常见肉类来源

于丽娟，张艳花，徐新明，吴伟伟，阿米尼古丽，玛尔孜娅，拉扎提，田可川

（新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830011）

在提取送检的未知肌肉组织样品以及市购的猪肉、牛肉、羊肉样品基因组DNA的基础上，分别选用1对通用引物与3对特异性引物进行扩增，用来检测未知样品的畜种来源。结果显示：通用引物扩增4种样品均出现阳性条带；分别用羊、猪、牛的特异性引物扩增样品DNA，送检未知样品只在牛特异性引物扩增时出现了特异性目的条带。经PCR产物直接测序及同源性比对进行验证确认，该未知样品与牛的同源性为100%，从而验证了该方法的准确性。

聚合酶链式反应技术；鉴定；常见肉类；线粒体DNA

随着人们生活水平的不断提高，人们对肉类的需求量越来越大。近年来，在国内及国际贸易中，许多不法个体商人为了牟取高额利润，用低价格的肉冒充高价格的肉，比如用猪肉冒充牛羊肉等造假行为最为常见，这不仅影响了消费者的健康，而且还会涉及到宗教信仰等问题，致使人们越来越关注肉类食品的动物来源［1］。由于许多制假及掺假肉食品，在宏观形态学方面不易辨别，为此，执法机关对市面上的样品进行鉴定时需要一种科学准确的方法，为打假掺杂提供证据。因此，对未知的动物组织进行畜种源性鉴定，一直是科研人员致力解决的问题。

近年来，PCR技术因其灵敏、快速、操作简便等优点，在肉类和物种鉴定应用中得到了快速发展，成为肉类鉴别及肉类掺假检验的主要技术［2］。mtDNA由于稳定性好、拷贝数多、无组织特异性等优点，常作为目标基因被用于物种鉴定。其中，经常被用于扩增线粒体DNA的区域包括细胞色素 b、D-loop、12S rRNA、16S rRNA、ATP6和ATP8等［3］。本研究参考相关文献，利用PCR方法对有关部门送检的肌肉组织样品进行种属鉴定，为相关执法部门打击不法商贩、维护消费者合法利益提供有力科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 1份样品来自有关部门送检的未知动物肌肉组织样本，另外3份分别为生鲜羊肉、生鲜牛肉和生鲜猪肉，均购于市场。

1.1.2 主要试剂和设备 琼脂糖、Taq酶、dNTPs、Marker（DL2000）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等均购自大连宝生物有限公司；ABI 9700PCR仪（美国ABI公司）、DYY-Ⅲ32型平板电泳槽（北京市六一仪器厂）、UV-1000凝胶成像系统（北京宾达英创科技有限公司）、BECKMAN ND-1000 Spectrophotometer分光光度计（美国）、3－16K型低温离心机（Sigma，德国）等。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 每个样品称取30 mg，按照天根生化科技有限公司生产的产品DP304-血液、组织、细胞基因组提取试剂盒的说明书的操作步骤对样品进行全基因组提取。

1.2.2 PCR扩增 引物序列及扩增片段长度见表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

PCR扩增反应体系25 μL：10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTPs 2.0 μL（2.5 mmol/L），引物各1 μL（2.5 pmol/μL），Taq酶0.5 μL（5 U/μL），模板DNA 1.5 μL（空白对照加ddH2O），ddH2O补至25μL。

通用引物扩增条件：95℃预变性4 min，94℃45 s，69℃90 s，72℃60 s，35个循环，72℃延伸7 min。牛特异性引物扩增条件：95℃预变性4 min，94℃45 s，63℃30 s，72℃60 s，30个循环，72℃延伸7 min。羊特异性引物扩增条件：95℃预变性4 min，94℃45 s，59℃30 s，72℃60 s，30个循环，72℃延伸7 min。猪特异性引物扩增条件：95℃预变性3 min，94℃30 s，60℃20 s，72℃20 s，35个循环，72℃延伸5 min。

1.2.3 PCR产物纯化和测序 利用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，送上海生工生物工程公司进行序列测定。

表1 引物序列及扩增片段长度

2 结果与分析

2.1 通用引物扩增结果

图1 通用引物检测不同样品PCR电泳图

采用通用引物对送检样品、猪、牛、羊肌肉组织样品所提取的DNA进行PCR扩增，均检测出阳性条带，其中牛和羊的目的片段均为234 bp，猪的目的片段为239 bp，如图1。

图2 羊特异性引物PCR扩增不同样品电泳图

2.2 特异性引物扩增结果

用羊特异性引物扩增样品DNA时，只有4号市购羊肉样品中检测出了特异性条带，其他样品未检测出特异性条带，如图2；用猪特异性引物扩增样品DNA时，只有2号市购猪肉样品中检测出了特异性条带，其他样品均未检测出特异性条带，如图3；用牛特异性引物扩增样品DNA时，1号送检样品与3号市购牛肉样品均检测出特异性条带，其余样品未检测出特异性条带，如图4。

图3 猪特异性引物PCR扩增不同样品电泳图

图4 牛特异性引物PCR扩增不同样品电泳图

2.3 PCR产物的测序结果

将牛特异性引物扩增送检样品的PCR产物的测序结果用BLAST2.2.9进行匹配查询基因库比对，此序列与牛（Bos taurus）线粒体DNA D-loop区序列同源性达到100%，如图5。

图5 送检样品线粒体DNAD-loop区部分片段测序结果

3 讨论

近年来，由于聚合酶链式反应（PCR）技术具有较高的灵敏度和特异性，使得以PCR技术为基础的检测方法被广泛应用于肉类食品的种属鉴定。许多研究者根据不同物种基因序列设计特异性引物，然后利用特异性引物扩增目的片段，通过电泳检测鉴别肉类食品中可能的物种来源［8］。

在靶基因选择方面，线粒体基因组DNA由于具有结构简单、母系遗传、高度的物种特异性、拷贝数多、加热时不容易被彻底破坏，存活机率大，更容易被扩增，不会发生基因重组等优点成为肉类食品种属鉴定的首选靶标［9］。经查阅相关文献分析总结，Cytb基因、D-Loop区、12S rRNA、16S rRNA、ATP6和ATP8等线粒体基因常被选用作为肉种类鉴定的PCR扩增区域。马伊萨兰等［10］利用Cytb基因序列分析鉴定肉制品掺假；张全芳等［11］据山羊、绵羊和狐狸线粒体16S rRNA基因间序列差异，设计特异性引物，建立了3种肉类成分快速检测的多重PCR方法。王兰萍等［12］通过扩增黄牛肉、牦牛肉和水牛肉的12S rRNA序列并结合测序结果来鉴别牛肉的种源。本研究中，首先利用几种动物的通用引物，分别扩增猪肉、牛肉、羊肉及送检未知样品的16S rRNA序列，4个样品均为阳性。然后分别用猪肉、牛肉、羊肉的特异性引物分别扩增4个样品的mtDNA中的保守序列，结果显示，送检未知样品只在牛特异性引物扩增时出现了特异性条带。经PCR产物直接测序及同源性比对进行验证确认，该未知样品与牛的同源性为100%，从而验证了该方法的准确性。因此，结合运用PCR扩增和DNA测序技术是一种精确可靠的方法，能够有效地运用于常见肉类的种源鉴别。该方法可为相关食品监管部门鉴别肉制品掺假造假提供技术支持。

4 结论

本实验通过利用通用引物与特异性引物PCR扩增的方法来检测送检样品的畜种来源，并通过直接测序验证其结果的可靠性，最终确定送检样品为牛肉，进一步证明该方法用于猪肉、牛肉、羊肉等常见肉类种属鉴定的可信性。

［1］ 熊蕊，郭凤柳，刘晓慧，等.牛羊肉中掺杂猪肉的PCR方法的建立和初步应用［J］.食品工业，2014，35（8）：199-202.

［2］ 薛超波，王萍亚，李素芳，等.基于PCR多物种鉴定技术及其在肉类鉴定中的应用［J］.食品安全质量检测学报，2016，7（2）：562-566.

［3］ 高敬，魏迪，张癸荣，等.常见肉类鉴别技术研究进展［J］.食品科学，2014，35（11）：356-360.

［4］ Bottero MT，Civera T，Nucera T，et al.Design of universal primers for the detection of animal tissues in feedstuff［J］.ProQuest Agriculture Journal，2003，27：667-669.

［5］ Tartaglia M，Saulle E，Pestalozza S，et al.Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds：a molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials［J］.Journal of Food Protection，1998，61：513-518.

［6］ Bottero M T，Dalmasso I A，Nucera T，et al.Development of a PCR assayfor the detection of animal tissues in ruminant feeds［J］.Journal ofFood Protection，2003，66：2307-2312.

［7］ Dooley J B，Kelly E P，Stephen D G，et al.Detection of meat species using Taqman real-time PCR assays［J］.Meat Science，2004，68：431-438.

［8］ 何玮玲，张驰，杨静，等.食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法［J］.中国农业科学，2012，45（9）：1873-1880.

［9］ 任君安，黄文胜，葛毅强，等.肉制品真伪鉴别技术研究进展［J］.食品科学，2016，37（1）：247-256.

［10］马伊萨兰，吕明星，唐俊妮，等.用Cytb基因序列分析鉴定肉制品掺假［J］.中国食品卫生杂志，2016，28（1）：48-51.

［11］张全芳，马德源，刘艳艳，等.利用多重PCR技术检测羊肉中掺杂狐狸肉的方法研究［J］.山东农业科学，2014，46（12）：4-6.

［12］王兰萍，耿荣庆，王伟，等.基于线粒体12S rRNA基因序列鉴别牛肉的种源［J］.家畜生态学报，2013，34（2）：19-21.

Application of PCR Technique in the Identification of Species Origin of Common Meat

Yu Lijuan，ZhangYanhua，Tian Kechuan，et al
（Institude ofAnimal Science，XinjiangAcademyofAnimal Science，Urumqi 830011，China）

The DNA samples were extracted from unknown muscle tissue sample，pork，beef and mutton for PCR amplification using one pair ofuniversal primers and three pairs of specific primers，in order to detect the species of the unknown muscle tissue sample.The result showed that both positive bands appeared when four samples were amplified by universal primers；When DNA samples were amplified by specific primers，the unknown samples appeared specific target band under using bovine specific primers.The PCR products were sequenced and homology alignment was verified，the result showed that the homology between unknown sample and cattle was 100%，toverifythe accuracyofthe method.

polymerase chain reaction（PCR）technique；identification；common meat；mitochondrial DNA

S826.2

A

2095-3887（2016）05-0007-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.05.002

2016-08-01

新疆维吾尔自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目“细毛羊毛品质性状相关基因功能鉴定及生物信息学分析”；新疆绒毛用羊遗传育种与繁殖重点实验室（XJYS1105）

于丽娟（1986-），女，助理研究员，硕士。研究方向：动物分子遗传。

田可川（1963-），男，研究员，博士。研究方向：动物遗传育种。