何婷婷，王 卉，徐白萱，刘 健，张小军，田嘉禾

（1.解放军总医院海南分院，海南 三亚 572013；2.解放军总医院，北京 100853）

◁腹部影像学▷

不同侵袭转移特性肝癌模型的18F-FDG和2-18F-乙酸盐联合显像

何婷婷1，王 卉1，徐白萱2，刘 健2，张小军2，田嘉禾2

（1.解放军总医院海南分院，海南 三亚 572013；2.解放军总医院，北京 100853）

目的：探讨18F-FDG和2-18F-乙酸盐联合显像在区分不同转移潜能的肝癌裸鼠模型中的意义。方法：以人肝癌细胞株HepG2和QGY7701为研究对象进行体外侵袭实验，判断细胞侵袭转移能力的大小。通过体外核素摄取实验观察两株肝癌细胞18F-FDG和2-18F-乙酸盐的摄取差异性，并建立皮下荷瘤模型进一步观察两种示踪剂的活体显像特征，绘制感兴趣区（ROI）并计算瘤/非瘤比值。结果：HepG2细胞体外侵袭能力大于QGY7701（P＜0.05）。HepG2细胞的18F-FDG和2-18F-乙酸盐摄取率均高于QGY7701，其摄取差异有统计学意义（P＜0.05）。两株细胞18F-FDG摄取率与侵袭能力呈正相关（r=0.657，P＜0.05）。活体显像中HepG2肿瘤组织的18F-FDG和2-18F-乙酸盐的摄取值亦高于QGY7701，其中18F-FDG的摄取差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：18F-FDG摄取值能够反映肝癌细胞侵袭转移能力的大小；同时18F-FDG Micro-PET显像能够区分两种肝癌模型，提示18FFDG显像有助于预测肝癌的不同侵袭转移潜能力。

肝肿瘤；氟脱氧葡萄糖F18；乙酸盐类；正电子发射断层显像术

肝细胞癌 （HCC）是我国常见的消化道肿瘤之一，目前对于HCC的研究提出了“生物学特性”这一全新理念，其诊断不仅依赖病理分型、临床分期、影像学和肿瘤标志物，更要注重其生物学特性的改变，侵袭转移作为HCC生物学特性的核心，更是研究的重中之重。而PET/CT凭借其功能成像的优势，从分子水平判别肿瘤活性，真正实现了“活体分子成像”。因此本研究联用18F-FDG和 2-18F-乙酸盐 （18FFAC）两种显像剂，观察转移潜能不同的肝癌裸鼠模型的活体显像特征，发掘显像剂摄取与HCC侵袭转移特性的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂

HepG2和QGY7701肝癌细胞作为研究对象，培养液为DMEM高糖培养基 （PAA Laboratories GmbH，Austria），10%胎牛血清 （Bio international Limited，Newzeland）。

1.2 细胞侵袭实验

在24孔板中加入含10%胎牛血清的细胞培养液DMEM，将细胞悬液加入Transwell小室中，将小室浸于培养液中，37℃，5%CO2孵箱内孵育24 h，取出小室，滤膜用多聚甲醛固定15min，PBS冲洗后用0.5%结晶紫染色，染色后用棉签擦掉膜上层未穿过的细胞，镜下观察已穿过滤膜的细胞。用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上562 nm测其光密度（OD）值。

1.3 细胞摄取结合实验

12孔板各孔中加入示踪剂（18F-FDG，18F-FAC）100μL，置入5%CO2培养箱中培养；并向一空白管中加入同样剂量示踪剂，置入井型γ-计数仪中计数，记录。示踪剂与细胞共同孵育60min后取上清液，用PBS液冲洗3次，每孔加入胰酶0.5mL，孵育后用DMEM培养液1mL中和，吹打均匀，将细胞悬浊液移至小试管中，置入井型γ-计数仪中计数，记录。同时测量空白管γ-计数。每个数据取3个平行孔，实验至少重复3次以上。

1.4 动物模型建立

4周龄BALB/C裸小鼠20只，雄性，体质量15～20 g，购自军事医学科学院动物中心，饲养于无病原（SPF）条件层流室。无菌条件下，裸鼠前、后肢皮下接种0.5mL细胞悬液，接种细胞密度为1×107个/mL，接种后饲养于恒温、恒湿条件下，每隔4 d观察肿瘤生长情况，测量肿瘤直径并计算肿瘤体积，公式为V=1/2ab2（V：肿瘤体积，a、b分别为肿瘤的长径和短径）。当瘤体直径达8～10mm时进行动物显像。

1.5 荷瘤小鼠Micro-PET显像

利用FDG模块自动化合成18F-FDG和2-18F-乙酸盐，薄层色谱法 （TLC）和高效液相色谱法（HPLC）检测放化纯均＞99%。Micro-PET/CT为GE公司Explore vista small animal PET/CT成像系统。18F-FDG显像前禁食4 h。荷瘤小鼠经尾静脉分别注射18.5MBq（0.5mCi）18F-FDG和2-18F-乙酸盐，于注射后50～60min行静态显像，显像时间10min，采用3D数据重建模式，通过Image J图像处理软件绘制感兴趣区（ROI）并计算瘤/肺（T/L）比值。

1.6 数据统计

2 结果

2.1 细胞侵袭实验及摄取结合实验的结果分析

侵袭实验中见较多HepG2细胞和QGY7701细胞穿越基质胶和滤膜，前者穿越的细胞数明显高于后者（图1），其OD值差异有统计学意义（P＜0.05），说明HepG2细胞的侵袭能力高于QGY7701。HepG2细胞的18F-FDG和18F-FAC摄取率均大于QGY7701，其差异均有统计学意义 （P＜0.05）（图2a），相关分析结果显示18F-FDG摄取率与细胞侵袭能力呈正相关（相关系数=0.903，P＜0.05）（图2b）。

2.2 动物荷瘤模型的生长特性

两株细胞致瘤率均为100%，HepG2（9.8 d）平均成瘤时间小于QGY7701（11.2 d），其差异无统计学意义（P＞0.05）。分别于第4、8、12、16天测量体积。第4天和第8天，肿瘤体积无显著差异（P＞0.05），第12天和第16天，HepG2肿瘤体积大于QGY7701，其差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 动物模型显像

18F-FDG显像中，裸鼠头颈部腺体摄取明显，肩胛骨、肋骨处肌肉组织摄取增高，考虑麻醉时挣扎过度所致。心肌显影明显，肠道偶见点状摄取性摄取增高（图3），皮下瘤体放射性摄取明显增多，部分瘤体呈环状浓聚（图4a）。18F-FAC显像中，全身软组织摄取均匀增高，脊柱摄取增高，消化道内见大量放射性浓聚（图3），皮下瘤体放射性摄取亦明显高于肺（图4b），体积过大的瘤体中心有不同程度的放射性摄取减低，与对侧肌肉相比摄取基本一致或略低。部分瘤体内部放射性摄取不均一，且两种示踪剂最浓聚区域不完全一致。HepG2的18F-FDG（3.83±0.82 vs 2.71±0.29）及18F-FAC（3.42±0.35 vs 3.15±0.13）摄取均高于QGY7701，同一示踪剂中HepG2的摄取高于QGY7701，其中18F-FDG显像中，HepG2的瘤/非瘤（T/NT）比值明显高于QGY7701（3.83±0.82 vs 2.71±0.29，P＜0.05），见表1。

Table 1 The uptake of dual tracers in two HCC cells(x±s)

3 讨论

肿瘤的侵袭转移是一个多因素、多步骤的复杂生物学进程，各种酶类、细胞因子、基因和蛋白参与其中，国内外工作者已针对肝癌的转移侵袭开展了大量关于生物学特性的实验研究，证明多种蛋白、酶、细胞因子等与肿瘤转移能力有相关性，能够反映肝癌细胞不同转移潜能的大小。虽然肝癌研究中生物学技术灵敏性好、精准度高，但不能活体监测相关指标的变化，而PET/CT能够利用不同示踪剂动态监测体内肿瘤细胞的活性，帮助实现肿瘤生物学行为的可视化研究。

图1 HepG2（左）和QGY7701（右）细胞侵袭实验。Figure 1.HepG2(left)and QGY7701(right)cell invasion assay.

图2a HepG2和QGY7701细胞摄取实验。Figure 2a.Cell uptake assay of HepG2 and QGY7701.

图2b 18F-FDG摄取与OD值的散点图分析。Figure 2b. Scatterplots of18F-FDG uptake and OD value.

图3 正常裸鼠18F-FDG和18F-FAC Micro-PET显像。 图4 HepG2和QGY7701皮下荷瘤模型Micro-PET显像。图4：18F-FDG显像；图4b：18F-FAC显像。

Figure 3.18F-FDG and18F-FAC Micro-PET imaging of normal nude mice.Figure 4.Micro-PET imaging of HCC subcutaneous tumor-bearing models.Figure 4a:18F-FDG imaging;Figure 4b:18F-FAC imaging.

目前尚无与肿瘤侵袭转移特性相关的靶向探针的相关研究，因此本实验选择18F-FDG及18F-FAC作为示踪剂，观察不同侵袭转移特性HCC细胞的摄取特征，及两种示踪剂与细胞体外侵袭能力的相关性。18F-FDG作为临床中常用的代谢类显像剂，其摄取值不仅与肿瘤的恶性程度（分级）呈正相关，还与复发转移、生存预后及相关预测因子关系密切[1-3]，本实验通过体外侵袭实验发现HepG2细胞的侵袭能力明显大于QGY7701，前者FDG摄取值也高于后者，说明不同侵袭能力肝癌细胞的FDG摄取值是有明显差异的，并对两株细胞的FDG摄取值和侵袭能力进行相关分析，发现FDG摄取值与侵袭能力大小呈正相关，说明18F-FDG摄取值高低能够反映肝癌细胞体外侵袭能力的大小。而18F-FAC在体内代谢途径与18F-FDG不同，在体内先转化为氟乙酸，与三羧酸循环中柠檬酸结合，生成氟柠檬酸被肿瘤细胞摄取，其生物学分布与11C-aceret相似[4]，且肝脏清除率高[5]，国外学者[6-7]将18F-FAC用于前列腺癌的诊断，并与11C-aceret进行比较，研究表明18F-FAC摄取值明显高于11C-aceret[7]，能够替代11C-aceret用于前列腺的诊断。也有研究表明11C-acetate对HCC（尤其是高分化HCC）具有诊断灵敏度高的优势[8]，特别是联合18F-FDG进行双示踪剂显像，能够大大提高HCC诊断的灵敏度及转移病灶的诊断率[8-9]，但18F-FAC应用于肝脏肿瘤显像的基础研究尚未见报道。本研究初次将18F-FAC用于HCC细胞和动物模型显像，发现高侵袭力的HepG2细胞的18F-FAC摄取值亦高于QGY7701，但其摄取值与侵袭力并无显著相关性，又进一步结合18F-FDG和18F-FAC对两株HCC细胞的荷瘤模型进行Micro-PET显像，结果显示18F-FAC在肿瘤组织和肌肉组织中存在差异性摄取，说明18F-FAC可被HCC组织摄取，其代谢产物积聚在肿瘤细胞内，但18F-FAC在体内的代谢机制和途径仍有待进一步研究。而且同一HCC模型中18F-FDG摄取高于18F-FAC，但18F-FDG和18F-FAC摄取区域不完全一致，18F-FDG摄取增高区域内18F-FAC摄取较低，而18F-FDG摄取较低区域内出现18F-FAC的高摄取，说明两株HCC细胞混合存在糖代谢和脂肪酸代谢双代谢途径，且糖代谢较脂肪酸代谢活跃。HepG2肿瘤组织的18F-FDG摄取值明显高于QGY7701，与体外细胞摄取实验结果一致，说明前者肿瘤组织内糖代谢高于后者。而HepG2肿瘤组织的18F-FAC摄取值虽然高于QGY7701，但两者并无显著差异，提示肿瘤细胞和肿瘤组织的摄取能力存在一定差异性，在研究中要综合考虑体外、体内微环境和其他可能相关因素差异对实验结果产生的影响，才能得出更全面、准确的结论。

综上所述，不同侵袭转移能力的HCC细胞的18F-FDG、18F-FAC摄取特征有显著差异，18F-FDG摄取值能够反映HCC细胞侵袭转移能力的大小；同时18F-FDG Micro-PET显像能够区分两种HCC模型，提示18F-FDG显像有助于预测HCC的不同侵袭转移潜能，为肿瘤的生物学行为提供有利的影像学信息。

[1]Higashi T,Hatano E,Ikai I,et al.FDG PET as a prognostic predictor in the early post-therapeutic evaluation for unresectable hepatocellular carcinoma[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2010, 37(3):468-482.

[2]Salem N,Kuang Y,Wang F,et al.PET imaging of hepatocellular carcinoma with 2-deoxy-2[18F]fluoro-D-glucose,6-deoxy-6[18F] fluoro-D-glucose, [1-11C]-acetate and [N-methyl-11C]-choline[J].Q J Nucl Med Mol Imaging,2009,53(2):144-156.

[3]Kim YK,Lee KW,Cho SY,et al.Usefulness18F-FDG positron emission tomography/computed tomography for detecting recurrence of hepatocellular carcinoma in posttransplant patients[J].Liver Transpl,2010,16(6):767-772.

[4]张锦明，田嘉禾，姚树林，等.FDG模块自动化合成2-18F-乙酸盐及其临床前研究[J].中华核医学杂志，2007，27（4）：215-217.

[5]Lindhe O,Sun A,Ulin J,et al.[(18)F]Fluoroacetate is not a functional analogue of[(11)C]acetate in normal physiology[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2009,36(9):1453-1459.

[6]Matthies A,Ezziddin S,Ulrich EM,et al.Imaging of prostate cancer metastases with18F-fluoroacetate using PET/CT[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2004,31(5):797.

[7]Ponde DE,Dence CS,Oyama N,et al.18F-fluoroacetate:a potential acetate analog for prostate tumor imaging—in vivo evaluation of18F-fluoroacetate versus11C-acetate[J].J Nucl Med，2007,48 (3):420-428.

[8]Ho CL,Yu SC,Yeung DW.11C-acetate PET imaging in hepatocellular carcinoma and other liver masses[J].J Nucl Med，2003, 44(2):213-221.

[9]Ho CL,Chen S,Yeung DW,et al.Dual-tracer PET/CT imaging in evaluation of metastatic hepatocellular carcinoma[J].J Nucl Med，2007,8(6):902-909.

Binding18F-FDG and18F-fluoroacetate M icro-PET imaging in human HCC model

HE Ting-ting1,WANG Hui1,XU Bai-xuan2,LIU Jian2,ZHANG Xiao-jun2,TIAN Jia-he2
(1.The Hainan Branch of the PLA General Hospital,Sanya Hainan 572013,China; 2.The PLA General Hospital,Beijing 100853,China)

Objective:The aim of study was to evaluate whether the18F-FDG and18F-fluoroacetate(18F-FAC)could be used to distinguish the different metastatic potential of hepatocellular carcinoma(HCC)models.Methods:Human HCC cell lines HepG2 and QGY7701 were cultured and implanted into nude mice to create HCC models.In vitro cell invasion assay was performed to judge invasion ability.Uptakes of18F-FDG,18F-FAC in two cells were assessed by in vitro uptake assay.In vivo imaging of tumor-bearing mice were obtained by animal PET/CT after injection of each tracer.ROI(region of interest)was drawn over tumor and lung to calculate T/NT(tumor/non-tumor).Results:The invasion ability of HepG2 was much higher than QGY7701(P＜0.05),and the uptake ratio of18F-FDG and18F-FAC in HepG2 was higher than that in QGY7701(P＜0.05)in vitro uptake assay.The18F-FDG uptake of cells correlated with invasion capability(r=0.657,P＜0.05).Meanwhile,in Micro-PET/ CT study,the uptake of18F-FDG and18F-FAC in HepG2 tumor was higher than that in QGY7701 tumor(P＜0.05).Conclusion:High uptake of18F-FDG reflects higher invasion ability of HCC cell.Meanwhile,there is differentiation between two HCC models in18F-FDG Micro-PET imaging.It indicates that18F-FDG PET imaging could help to predict metastasis ability of HCC.

Liver neoplasms;Fluorodeoxyglucose F18;Acetates;Positron-emission tomography

R735.7；R817.4

A

1008-1062（2016）04-0267-04

2015-08-31；

2015-09-20

何婷婷（1982-），女，湖南人，主治医师。Email：htt_bmw＠163.com

田嘉禾，解放军总医院，100853。Email：tianjh＠vip.sina.com

三亚市医疗卫生创新项目（2015YW27）。