付忠华 刘 月 辛立卫 张春光 陈永刚

（梨树县兽药监察所，吉林梨树 136500）

FAT/CD36基因在不同品种肉牛眼肉中差异结合microRNAs

付忠华 刘 月 辛立卫 张春光 陈永刚

（梨树县兽药监察所，吉林梨树 136500）

在Gene Bank中查找牛脂肪酸转位酶（fatty acid translocase，FAT/CD36），设计并合成巢式PCR引物，以6个品种牛肌眼肉组织DNA为模板，扩增获得1689bp和945bp目的片段，测序发现在197bp发生A/T突变，导致不结合bmo-mir-3232，新结合mtrmiR5277，odi-let-7b，str-miR-8400-3p。

脂肪酸转位酶 调控区 单核苷酸多态性 微小核糖核酸

眼肉具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点，营养丰富，一直是世界肉业发达国家肉类消费的首选，而我国的牛肉消费量也在逐年上升，影响牛肉品质的因素众多，肌内脂肪沉积是牛肉品质的一个关键，更是大理石花纹评定牛肉等级的关键指标［1，2］。脂肪的生成是一个复杂的过程，有900多个数量性状的候选基因对脂肪沉积进行调控［3］。国内外对其进行了广泛而深入的研究，而脂肪酸转位酶也是控制肌内脂肪沉积的一个重要基因。

脂肪酸转位酶（fatty acidtranslocase，FAT/CD36）是一种在体内分布十分广泛的膜糖蛋白，并且在脂肪酸的跨膜转运中起着非常重要的作用，由 472 个氨基酸组成，其分子量约为 53kD a［4］。FAT/CD36 是一种细胞膜上的单链跨膜转运蛋白，具有发卡样的结构，由胞内区、跨膜区和胞外区三部分组成。其羧基末端（C端）和氨基末端（N 端）各有一个连续的疏水氨基酸区，两个疏水末端固定在胞膜上，使其长链绝大部分延伸在胞外。FAT/CD36广泛分布于机体脂肪、心肌、骨骼肌、脾脏及小肠等组织。此外，血小板、红细胞、单核细胞和乳腺上皮细胞也检测出 FAT/ CD36 的表达［5］。近年来的研究表明，除细胞膜外，FAT/CD36 还可能存在于细胞内的囊泡膜和线粒体膜上。FAT/CD36 属于 B 类清道夫受体家族蛋白成员之一，其配体包括胶原、凝血原敏感素、红细胞、低密度脂蛋白、天然脂蛋白、氧化的磷脂和长链脂肪酸等［6-8］。

FAT/CD36在脂代谢中的作用脂肪酸是细胞重要的能量来源，在安静或运动状态下机体骨骼肌主要由 LCFA氧化供能，而机体组织摄取脂肪酸的过程主要通过被动扩散，这个过程是由转运蛋白介导的，在很大程度上可以通过转运蛋白的转位进行调节［9］。研究发现FAT/CD36 在 LCFA 的转运过程中发挥着重要作用［10］。也有研究发现，FAT/CD36 在脂肪酸氧化过程中也发挥着重要作用。研究发现大鼠的腓肠肌中 CPT1 与 FAT/CD36 发生免疫共沉淀，提示 FAT/CD36 与 CPT1 在转运 LCFA 进入线粒体进行氧化存在着一种协同作用。在小鼠体外实验中，CPT1 的活性可以被 FAT/CD36 的抑制剂 SSO 所抑制［11］。但在另一项实验研究中发现，SSO 对人股外侧肌线粒体 CPT1 的活性没有影响，其氧化棕榈酰肉碱的能力下降了 92 %［12］。这一现象提示，FAT/CD36 可能作为 CPT1 的下游蛋白来调节 LCFA 的氧化。这些说明FAT/CD36在线粒体有氧氧化过程中发挥着重要作用。

MicroRNAs与脂代谢密切相关，越来越多的研究表明，microRNAs 可以通过与脂类代谢相关基因靶位点结合在转录后水平参与调节脂肪酸和胆固醇等多个层面的脂类代谢。目前，关于肌肉发育的机制还不是很清楚，但是在肌细胞的增殖、分化过程中许多调节因子都发挥着重要作用，microRNAs也在其中发挥重要的调节作用。microRNA的结合位点通常位于mRNAs的3′-UTR（非翻译区域）［13］。RNA沉默中，microRNA的功能是通过碱基配对与靶mRNAs结合后作为其结合物的向导［14］。在mRNAs的5’端包括2-7位置的区域的核苷酸对于靶标结合是相当关键的，并且已经被定义是microRNA种子序列。microRNA的下游核苷酸序列（尤其是8核苷酸和13-16位置的核苷酸同样重要）也同样与靶mRNA碱基配对结合。

1 材料与方法

1.1 肌肉组织样品

由梨树县种牛站提供的平均年龄约为5岁的本地黄牛、夏洛莱牛、延边牛、弗莱维赫牛、利木赞牛和安格斯牛等6头种公牛牛肋脊部眼肉组织，用提前经过灭菌的镊子和手术刀片分别取100g并切成小块分装，装在纱布袋里，拴好并在绳上粘上标签，立即放入液氮罐中冷冻备用。

1.2 引物设计

在NCBI数据库找到牛脂肪酸转位酶（fatty acidtranslocase，FAT/CD36），利用Primer 5.0引物设计软件，再用软件Oligo 6进行引物评估，对3′-UTR设计特异引物，由上海生工合成引物。依据引物设计原则，进行巢式PCR，对6种牛的FAT/CD36基因所用引物，见表1。

表1 FAT/CD36基因3′UTR扩增引物

1.3 基因组DNA的提取及目的片段扩增

依照天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的方法步骤进行DNA提取。琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的纯度：取2μl基因组DNA样品，在80V电压条件下，采用1%琼脂糖凝胶电泳30～60min左右。在紫外灯下观察电泳结果，并检测基因组DNA的完整性，保持备用。然后建立25μl的PCR反应体系：12.5mmol/ L Master Mixture、1μl上游和下游引物（20mmoL/L）、2μl模版DNA，最后加8.5μL灭菌超纯水至25μl。PCR运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s（需要经过梯度PCR仪设置温度梯度，来寻找各PCR引物最佳退火温度），72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增产物为预期目的条带，单一明亮，见图1的a和b。

图1 FAT/CD36基因PCR扩增产物

1.4 测序和分析

经琼脂糖凝胶电泳法检测正确，取20μL扩增产物，送样到上海生物工程单向测序。然后在Gene Bank中Blast相应基因序列进行比对分析，确定基因的序列结构。利用DNAStar，DNAMAN 4.0，BLAST等软件与Gene Bank中序列进行比较分析。利用数据库Target Scan，预测3′端非翻译区序列靶标microRNA及靶标microRNA核心种子区序列结合程度鉴定。应用RNAhybri，分析microRNA结构特征。

2 结果与分析

2.1 FAT/CD36基因3′-UTR的SNP位点

测序获得FAT/CD36基因3′-UTR的碱基序列，Blast后发现197bp处发生A/T突变，见图2的a和b。

图2 FAT/CD36基因3′-UTR序列

2.2 FAT/CD36基因的A/T突变位点序列峰图和基因型

根据测序结果分析得知，FAT/CD36基因的A/T突变位点在本地黄牛和延边牛的眼肉组织中的基因型是野生型AA，在夏洛莱牛、利木赞牛和安格斯牛的眼肉组织中的基因型是杂合型AT，在弗莱维赫牛的眼肉组织中的基因型是突变型TT，见图3的a、b和c。

图3 FAT/CD36基因中SNP的峰图

2.3 FAT/CD36基因的靶标microRNA结合分布

利用数据库Target Scan中筛选牛的miRNA数据，提交 FAT/CD36基因及其序列，可筛选到FAT/CD36基因的ENST00000544133.1区域可特异性的结合miR-145及其他非特异性的miRNAs，见图4a。而FAT/CD36基因的ENST00000447544.2区域没有可特异性的miRNAs，但有很多非特异性的miRNAs，见图4b。

图4 FAT/CD36的靶标miRNAs

2.4 FAT/CD36基因的靶标microRNA核心种子区序列结合程度及特征

筛选到FAT/CD36基因特异性结合miR-145的种子序列GUCCAGUUUUCCCAGGAAU，见图5a，其中核心序列是AACUGGA，见图5b，主要以2种方式结合，见图5c，而miR-145的环状发卡结构，见图5d。

图5 FAT/CD36的靶标miRNAs的特征

2.5 FAT/CD36基因的A/T导致miRNAs结合的变化

依据miRNA序列的特性，在发生A/T突变位点的上下游分别延伸20-30bp，检测SNP前后，FAT/CD36基因miRNAs的结合情况，研究发现，等位基因A位点可结合cel-miR-43-5p，cin-miR-4152-5p，bmo-miR-3232，lgi-miR-190，cel-miR-8212-5p，asumiR-5365b-3p，sma-miR-8450-3p，见图6a，而等位基因T位点可结合str-miR-8400-3p，odi-let-7b，lgi-miR-190，cel-miR-43-5p，mtr-miR5277，cin-miR-4152-5p，cel-miR-8212-5p，asu-miR-5365b-3p，sma-miR-8450-3p，见图6b，所以A/T发生后，不结合bmo-mir-3232，新结合mtr-miR5277，odi-let-7b，strmiR-8400-3p。

图5 A/T发生引起FAT/CD36基因与miRNAs结合变化

3 讨论和结论

通过数据库数据和实验结果得知，FAT/CD36基因可特异性的结合miR-145，而在本试验中没有筛选到miR-145，这可能是由于所扩增的目的片段不一致，并且本实验所检测到的SNP位点也不在与miR-145结合所在的种子序列区域内，所以本实验中的SNP对miR-145的影响不能确定。

根据197bp处的A/T突变和测序结果得知，在本地黄牛和延边牛的眼肉组织中的FAT/CD36基因型是野生型AA，可结合celmiR-43-5p，cin-miR-4152-5p，bmo-miR-3232，lgi-miR-190，cel-miR-8212-5p，asu-miR-5365b-3p，sma-miR-8450-3p。在弗莱维赫牛的眼肉组织中的FAT/CD36基因型是突变型TT，可结合cel-miR-43-5p，cin-miR-4152-5p，lgi-miR-190，cel-miR-8212-5p，asu-miR-5365b-3p，sma-miR-8450-3p，不结合bmomir-3232，新结合mtr-miR5277，odi-let-7b，str-miR-8400-3p。在夏洛莱牛、利木赞牛和安格斯牛的眼肉组织中的FAT/CD36基因型是杂合型AT，就有可能结合所有筛选到的miRNAs。

总之，FAT/CD36基因3′-UTR区域197bp处的A/T突变，可引起FAT/CD36与bmo-mir-3232，mtr-miR5277，odi-let-7b和strmiR-8400-3p 的结合变化，但是，它们对FAT/CD36基因表达是上调还是下降作用，需进一步试验验证。

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