马改妮，刘　珂，郇贝丽，魏建超，邵东华，李蓓蓓，邱亚峰，石元元，马志永

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

猪谷氧还蛋白I（GLRX1）基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

马改妮，刘珂，郇贝丽，魏建超，邵东华，李蓓蓓，邱亚峰，石元元，马志永

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

本研究针对猪GLRX1设计特异性引物，将PCR 扩增片段分别连接至T-easy 载体上构建重组质粒，经筛选、鉴定纯化后，10倍梯度稀释作为质控样品，用于实时荧光定量PCR中GLRX1标准曲线的构建，并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上；特异性结果表明只能检测到猪GLRX1扩增曲线；组内和组间变异系数均小于5%。本研究初步建立了检测猪GLRX1基因的SYBR Green荧光定量RT-PCR的方法，为后续对猪传染性疾病与猪GLRX1之间相互关系的研究提供了一种特异、灵敏的检测方法。

猪谷氧还蛋白；SYBR GreenⅠ；实时荧光定量PCR

谷氧还蛋白（glutaredoxin，GLRX），普遍存在于细菌、病毒和哺乳动物体内，其表达受干扰素（interferon，IFN）调控。人谷氧还蛋白有两种类型GLRX1和GLRX2，其中GLRX1分子量为12 kDa，由106～107个氨基酸残基组成，参与组成巯基-二硫键氧化还原酶家族，依靠谷胱甘肽（GSH）将氧化状态的蛋白质二硫键还原为巯基，从而对蛋白进行修复。大量研究表明GLRX1是一种具有多种生物学功能的多效性细胞因子，与调节氧化还原反应、细胞生长和抑制凋亡有密切关系，与人类某些疾病，如AIDS和细菌感染等的发生、发展也相关。

本实验室前期研究发现GLRX1可能是一种重要的抗病毒因子，但是其抗病毒作用的机制却没有相关报道。为进一步研究GLRX1的抗病毒机制及其与猪传染性疾病的相互关系，建立一种高效检测GLRX1的方法非常必要。本研究针对猪GLRX1基因保守区设计1对引物，拟建立一种能够稳定精确检测猪GLRX1基因表达的荧光定量RT-PCR方法，为针对GLRX1功能的进一步研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1猪组织样品所有猪组织样品均由上海奉贤区某猪场提供。

1.2主要试剂Trizol 试剂、反转录酶MLV、RNA 酶抑制剂、ExTaq DNA 聚合酶、SYBR Green Ex Taq II及快速反转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自康宁Axygen；T-easy载体购自Promega公司；动物组织RNA试剂盒、大肠杆菌DH5α购自天根公司。

1.3引物利用Beacon Designer 7，根据GenBank数据库中的猪GLRX1基因序列（登录号：NM_ 214233.1），针对其保守区设计特异性引物。Sus scrofa GLRX r1：5′-AGCCTGGGAAGGTGG TAGTTT-3′，Sus scrofa GLRX r2：5′-CTCGTTGG TGTCACTGGTGG-3′；Sus scrofa GAPDH 1R：5′-TCTGGCAAAGTGGACATT-3′，Sus scrofa GAPDH 2R：5′-GGTGGAATCATACTGGAACA-3′。利用Primer Primier 5.0引物设计软件设计猪GLRX1扩增引物。Sus scrofa GLRX 1a：5′-CCGGAATTCATGGCT CAAGCATTTGTGAACAGCA-3′，Sus scrofa GLRX 2a：5′-CCCAAGCTTTTTCAGAGCTCCAATTTGCT GCA-3′，全长为336 bp。引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.4细胞和组织中总RNA的提取及反转录按照Qiagen总RNA提取试剂盒说明书提取猪组织总R N A。以2 μ L总R N A为模板进行反转录，体系（20 μL）包含：Random Primer 1μL随机引物、5×反转录Buffer 4μL、DTT 2μL，dNTP mix(10 mmol/L) 1μL、1μL反转录酶（200 U/μL）、RNA RNase Inhibition（20U/μL） 1μL，混匀后于37℃水浴作用1.5 h，用于猪GLRX1扩增实验。细胞样品按照Trizol法说明书提取总RNA，使用快速反转录试剂盒进行反转录，总RNA为模板 2μL，DEPC水 6μL，RT Master Mix 2μL，反应产物用于实时荧光定量实验。

1.5阳性标准模板的建立以Sus scrofa GLRX 1a和Sus scrofa GLRX 2a为引物，扩增猪GLRX1。反应程序：98℃预变性5 min；98℃变性1 min，56℃退火15 s，72℃延伸10 s，共35个循环；72℃延伸10 min。回收纯化目的片段，与T-easy载体连接，转化至DH5α大肠埃希氏菌种，提取质粒进行PCR鉴定和序列测定，挑选结果正确的质粒并测定其浓度。

1.6SYBR Green｜实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.6.1SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 反应体系的建立及优化以质粒标准品为模板, 反应体系为20μL，分别对引物、模板、SYBR GreenⅠmix的最佳使用量，以及反应条件进行优化并绘制熔解曲线。

1.6.2标准曲线的建立将猪GLRX1标准品质粒进行10倍梯度稀释，稀释至10-4，并以系列稀释的标准质粒为模板，进行实时荧光定量PCR。反应体系包括2×SYBR Green Premix Ex Taq II 10μL、上下游引物各0.4μL（25 pmol/μL）、模板（质粒或cDNA）1μL、ROX Reference Dye (50×)0.4μL、DEPC水7.8μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性5 s，60℃退火、延伸34 s，扩增40 个循环。以Ct值为横坐标，以起始模板浓度的对数为纵坐标，绘制标准曲线。

1.7敏感性试验对标准品以10倍梯度稀释后进行将荧光定量PCR，反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。1.8 重复性试验对3份不同批次的阳性标准品进行批内重复试验和批间重复试验。

2　结果

2.1标准品的制备将反转录、PCR扩增获得的猪GLRX1基因与T-easy载体连接，对构建的重组载体进行PCR鉴定，获得约300 bp大小的DNA片段（图1），与目的片段相符，经测序结果与GenBank数据库中猪GLRX1基因相似度为99%，表明重组质粒构建成功。经测定重组质粒大小为336 bp。

图1　猪GLRX基因的PCR扩增Fig. 1　PCR-amplifi ed porcine GLRX gene

2.2SYBR Green I 实时荧光定量PCR标准曲线的建立对阳性重组质粒进行10倍梯度稀释，稀释至10-4，作为标准品进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为20μL, 结果各浓度有很好的线性关系。得到标准曲线方程为Y=-3.601X+3.37；Efficiency：0.90；R2：0.999（图2）。

2.3SYBR Green I 实时荧光定量PCR的熔解曲线根据参数95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 10 s绘制熔解曲线。结果显示，标准样品均出现了窄且尖的单峰，无杂峰出现，熔解温度为（74±0.5）℃（图3），表明该SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应为特异性扩增。

图2　实时荧光定量RT-PCR检测猪GLRX1的扩增曲线(A)和标准曲线(B)Fig. 2　Amplifi cation plots (A) and standard curve (B) of real time SYBR Green I fl uorescent quantitative RT-PCR

图3　SYBR Green ｜实时荧光定量PCR检测猪GLRX1标准品的熔解曲线Fig. 3　The melting curve of real time SYBR Green Ifl uorescence quantitative RT-PCR for porcine GLRX1　standard

2.4敏感性试验结果实时荧光定量PCR检测梯度稀释的标准样品，在35个循环内Ct 值＞ 0, 且相邻稀释梯度拷贝数呈10倍关系。PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳（图4），结果与实时荧光定量PCR结果相符。

图4　猪GLRX1标准品实时荧光定量PCR产物检测Fig. 4　qPCR detection for porcine GLRX1 standard

2.5SYBR Green｜实时荧光定量PCR的重复性对3份批次的猪GLRX1基因标准品分别做3个批内重复和3个批间重复，组内变异系数均小于1.5%，组间变异系数均小于5%（表1），重复性良好，进一步证实该方法检测猪GLRX1基因高效、可信。

表 1　荧光定量PCR组内和组间重复试验Table 1　Intra-and inter-assay repeatability of realtime SYBR Green I fl uorescent quantitative RT-PCR

3　讨论

我国是世界第一养猪大国，改革开放以来，我国养猪业保持着持续稳定的发展，养猪业已经成为我国农业与农村经济的支柱产业，是广大养殖农户的主要经济来源。我国养猪业正在从数量速度型向质量效益型转变，从粗放经营型走向集约经营，并取得了许多成绩。养猪业已成为我国农村和国民经济中相对独立的发展较快、产业化程度较高、经济效益较显著、科技贡献率较高的产业。但我国养猪业仍然存在许多问题，其中猪病流行尤为突出，每年造成重大的经济损失，给我国养猪业带来严峻的挑战，制约着我国养猪业的健康发展。其中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪瘟病毒、猪流感病毒以及猪伪狂犬病病毒等是引起我国猪病流行的重要病毒，我国畜牧兽医科技工作者投入大量的时间、精力研究这些病毒与猪机体反应的相互关系，为进一步了解病毒致病机制取得新的突破。

GLRX1是机体内特异、高效还原谷胱甘肽化蛋白的一种氧化还原酶相对分子质量较小，GLRX1充当电子供体调节着细胞中含巯基蛋白的氧化还原状态，参与氧化胁迫、细胞凋亡、蛋白修饰和细胞分化等多种生物过程，在细胞信号转导过程中发挥十分重要的作用。同时，GLRX1与人类健康密切相关，与心血管疾病、肿瘤，AIDS和细菌感染等的发生、发展有关，但GLRX1在动物病毒性感染中的作用研究目前还没有报道。

本实验室研究发现，在猪感染PRRSV过程中，GLRX1发挥着重要的免疫作用，猪GLRX1能够有效抑制PRRSV的复制。建立准确、稳定的GLRX1分子检测方法是进一步研究GLRX1在体内抗感染机制的重要基础。本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好，对3份不同批次的标准品分别进行3个批内重复和批间重复，变异系数均小于5%，可以定性和定量检测猪GLRX1的表达，实时分析样品中GLRX1基因的表达含量，也可以应用于其他猪病相关研究，为深入研究猪GLRX1的功能和机制打下基础。

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DESIGN AND VALIDATION OF REAL TIME FLUORESENCE QUANTITATIVE RT-PCR ASSAY FOR DETECTION OF PORCINE GLUTAREDOXIN

MA Gai-ni, LIU Ke, HUAN Bei-li, WEI Jian-chao, SHAO Dong-hua, LI Bei-bei, QIU Ya-feng, SHI Yuan-yuan, MA Zhi-yong

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The objective of the study is to establish a method for detecting porcine GLRX1 by SYBR GreenΙrelative fluorescence quantitative RT-PCR. Special primers based on porcine GLRX1 were designed. Then these amplifi ed fragments were cloned into T-easy. Using the recombinant plasmid as standard products, a real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to construct the standard curves of porcine GLRX1 and detect the sensitivity, specifi city and repeatability. The results showed a precise linear relationship with a correlation coeffi cient of R2＞ 0.99. The amplifi cation curve showing a single peak could only been detected for porcine GLRX1. The variation coeffi cient was less than 0.5% by within and between the groups of repeatability tests. The developed real-time PCR assay was highly specifi c, sensitive and reproducible, and could be an available tool for monitoring the relationship between pig infectious diseases and porcine GLRX1.

Porcine glutaredoxin(GLRX); SYBR Green I; real-time quantitative PCR assay

S852.42

A

1674-6422（2016）03-0078-05

2015-02-22

973计划（2014CB542700）

马改妮，女，硕士研究生，预防兽医学专业

马志永，E-mail：zhiyongma@shvri.ac.an