李丽　王奂玲　王桂芳　周静

（北京市水文地质工程地质大队北京100195）

北京地下水中土著反硝化细菌的分离及脱氮性能研究

李丽王奂玲王桂芳周静

（北京市水文地质工程地质大队北京100195）

依据本单位对北京市地下水的数年水质监测数据，选取10个硝酸盐污染的地下水水样，经溴百里酚蓝（BTB）变色培养基初筛及摇瓶培养，成功筛选分离出一株高效反硝化细菌，命名为3-Ⅰ。经16S rRNA基因序列分析，反硝化细菌3-Ⅰ与Rhizobium pusense sp和Beijerinckia fluminensis sp的同源性为99%。3-Ⅰ菌株能够以乙酸钠为唯一碳源，以硝酸盐及亚硝酸盐为氮源，摇瓶处理72h后在人工配水中硝酸盐去除率高达99.9%，且无亚硝酸积累；在编号为W 652、HJ121和HJ155的3个北京市地下水水样中的硝酸盐去除率均高于99.3%，也无亚硝酸盐积累，具有一定的工程应用价值。

地下水；硝酸盐氮污染；反硝化细菌

北京市是为数不多的以地下水作为主要供水水源的国际化大都市，地下水供水量占全市总供水量的2/3[1]。研究指出，目前北京市的地下水资源已经遭受不同程度的硝酸盐污染，北京市平原农区深层地下水硝态氮污染程度已接近甚至超过欧美国家，浅层地下水污染更为严重[8]。长期使用高硝酸盐含量的饮用水，可导致婴儿血红蛋白增高，也可能引起成年人与此相关的癌病发生，威胁人类健康[2-4]。许多国家和机构都规定了地下水中硝酸盐质量浓度标准，世界卫生组织（WHO）将饮用水中硝酸盐氮含量的最大允许值限定为11.3mg/L，美国规定其最大允许值为10mg/L，我国规定饮用地下水源的Ⅲ类标准中NO3-N含量不能超过20mg/L。因此，开展北京市地下水硝酸盐污染修复研究，具有重要的现实意义。

传统的饮用水处理工艺（絮凝沉淀-过滤-氯气消毒）对NO3-几乎无去除效果。目前，地下水硝酸盐去除方法主要有物理修复、化学修复及生物修复方法。其中，生物反硝化法具有投资小、维护费用低、操作简便、对环境安全、效率高、降解彻底以及对地理环境要求低等许多优点。脱氮微生物的存在，是生物脱氮作用进行的先决条件，因此，如何从自然环境或人工环境中分离筛选反硝化细菌，增加反硝化细菌的种属资源，一直是研究的重点。研究表明，国内外已发现并分离筛选出多种好氧反硝化细菌，如粪产碱杆(Alcaligenes faecalis)、异养球硫细菌(Thiosphaera pantotropha)、海洋假单胞菌(Pseudomonas nautical)和细小好氧反硝化菌(Microvirgulaaerodenitrifica)等50多个菌属[5-8]。反硝化细菌几乎存在于各种生境中，如果可以从受污染的地下水水体中筛选出一株或几株土著微生物，可具有较高的生态安全性，并对其进行驯化，强化其除氮效率，鉴定其安全性，在此方向上开展基础研究，可为今后在该地区开展生物修复技术研究提供基础资料。

本文从10个受硝酸盐污染的北京地下水水样中，成功分离筛选出一株高效反硝化细菌3-Ⅰ，并研究了其在硝酸盐人工配水和3个受硝酸盐污染的北京市地下水水样中的脱氮性能，其硝酸盐去除率可高达99%。

1材料与方法

1.1材料

培养基有以下几种：富集培养基：牛肉浸膏5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，KNO310g·L-1，pH 7.0，121oC，灭菌20min。反硝化菌基础培养基：乙酸钠5g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.30g·L-1，KNO31.30g·L-1，FeSO4·7H2O 0.07g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1g·L-1，CaCl2·7H2O 0.2g·L-1，pH 7.0，121℃，灭菌20min。

溴百里酚蓝培养基（BTB培养基）：乙酸钠5g·L-1，K2HPO4· 3H2O 1.30g·L-1，KNO31.30g·L-1，FeSO4·7H2O 0.07g·L-1，MgSO4· 7H2O 0.1g·L-1，CaCl2·7H2O 0.2g·L-1，BTB(质量分数为1%的乙醇溶液)1mL，去离子水溶解，用1mol·L-1NaOH溶液调节pH 7.0～7.1，120℃灭菌30m in，培养基呈墨绿色。以上培养基若需固体培养基，加入2%琼脂即可。

1.2水样的采集与保存

本实验共采集地下水样品10个，详细信息见表1。水样于24h内运回实验室待用。

表1采样信息

1.3水样中菌种的分离与筛选

1.3.1水样中菌种的富集驯化培养

吸取采集的地下水水样1mL至装有100m L富集培养基的200mL锥形瓶中，无菌封口膜封口，180r/min，30℃摇床培养，每隔2天取培养物接种至新鲜的富集培养基中，转接量为10%。连续富集驯化培养6～7次。

1.3.2水样中菌种的初筛

反硝化过程为碱增加过程，采用含有溴百里酚蓝（BTB）指示剂的选择性培养基进行反硝化菌的初筛[9]。将富集驯化后的菌悬液梯度稀释涂布于BTB培养基，置于30℃培养，直至出现变蓝的菌落或晕圈即确定为初筛的反硝化细菌，然后挑取变蓝或有晕圈的菌落重复划线培养，直至平板菌落无其他形态的菌落为止。

1.3.3水样中菌种的复筛

将初筛得到的菌株富集培养，吸取50mL菌液离心收集菌体，用反硝化菌基础培养基悬浮，离心以洗去附着的培养基，再用该培养基10mL悬浮菌体，取一定量测定OD600吸光值,以确定接入菌体的量。再将制备的菌悬液以相同的接菌量接入到100mL含硝酸盐的基础液体培养基中，每个菌株设3个重复，设不接菌的基础培养基为空白，上述操作均在无菌条件下进行。30℃恒温摇床180r/min振荡培养72h，将培养基离心过滤后，检测NO3-和NO2-的含量。

1.4菌株的16S rRNA分子生物学鉴定

16S rRNA序列分析：提取菌株的DNA作为16SrRNA的扩增模板。（1）95℃预变性5m in，（2）95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1m in30s；（3）第2步循环30次；（4）72℃延伸10min，4.0℃保存。得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后进行测序，测序结果在GenBank进行同源性分析。

1.5菌株在水中的硝酸盐去除性能研究

1.5.1菌株的生长曲线

将菌液以5%的转接量接入到新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30℃恒温摇床180r/min培养，每2h取4mL菌液稀释后测定OD600值，采用比浊计数法测定该菌不同时间的生长量，根据时间与OD600值的对应关系绘制菌株的生长曲线，明确菌株的生长规律。

1.5.2菌株的最适生长pH值

取过夜培养的新鲜菌液，以5%的接种量分别接种至pH值为5、6、7、8、9和10的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，180r/min摇床培养。分别于接种后的0、2、4、6、8、10、12和14h测其OD600值。

1.5.3菌株在人工配水中的脱氮性能研究

配制与污染地下水中硝酸盐含量接近的人工配水，组分为：乙酸钠5 g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.30 g·L-1，KNO30.340 g·L-1，FeSO4· 7H2O 0.07g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1，CaCl2·7H2O 0.2 g·L-1，pH 7.0。以5%的接种量接种到100mL人工配水中，不加菌的人工配水为空白，30℃180r/min摇床培养。分别于接种后24h、48h和72h测定硝酸盐含量。

1.5.4菌株在地下水水样中的脱氮性能研究

取编号为W 652、HJ121、HJ155的污染地下水水样，加入乙酸钠5g·L-1，以5%的接种量分别接种到100mL三个原水中，设置加入乙酸钠的原水为空白，分别于0h和接种后96h测定硝酸盐含量。

2结果与讨论

2.1菌株的初筛

采集的10个地下水水样经过富集与驯化，将培养液（混合菌群）梯度稀释涂布于BTB培养基，其中水样编号为W 911、W912和WR50的培养基变蓝，挑取变蓝或出现蓝色晕圈的菌落划线纯化，从W 911中分离到4株细菌，从W 912中分离到2株，从WR50中同样分离到2株，共纯化得到8株细菌。再将8株细菌划线培养于BTB培养基，最终得到4株使培养基变蓝的菌株，编号为1-Ⅰ、1-Ⅱ、2-Ⅰ和3-Ⅰ。

2.2菌株的复筛

初筛得到的4株菌株72h后的硝酸盐含量如表2所示，但是1-Ⅰ、1-Ⅱ、2-Ⅰ均产生较多的NO2-积累，不可用于地下水修复。3-Ⅰ菌株的硝酸盐去除率高达99.7%，且亚硝酸盐含量也符合国家地下水质量标准Ⅲ类要求[10]。

表2各菌株72h的脱氮性能数据

2.3菌株鉴定结果

将测序得到的序列与Genbank中相关序列比对，结果如表3所示，其与Rhizobium pusense strain NRCPB10和Beijerinckia fluminensisstrain UQM1685的同源性为99%。据文献报道，根瘤菌属Rhizobium pusense strain（NRCPB10）是分离自印度新德里种植鹰嘴豆的根际土壤，代表了一种新的根瘤菌属[11]。孙俊平也曾分离筛选出一株Rhizobium pusense sp在微生物采油和原油污染处理方面具有应用潜力[12]。弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminensis)可将滤纸条完全崩解，其所在复合菌系对苦参残渣和稻秆有降解能力[13]。

表3菌株3-Ⅰ16s RNA基因同源性比对结果

3-Ⅰ菌株还需生理生化试验及其电镜结果来进一步完成鉴定。据文献报道[14]，根瘤菌属具有良好的固氮作用，在氧气充足的情况下，能够利用空气中的氮，但是在氧气贫乏或溶解氧少的环境下，可以利用NO3-、NO2-作为氮源生长。在本文的实验过程中，3-Ⅰ菌株能够在贫氧条件下有效去除水中的硝酸盐，因此，推测其属于根瘤菌属的可能性极大。

2.4菌株的生长曲线和适生长pH值

3-Ⅰ的生长曲线如图1，在牛肉膏蛋白胨培养基中，该菌在0～2h时处于延迟期，2h后进入对数生长期，6h时对数生长期结束，进入稳定期，下一步实验可在菌体处于稳定期8h时取样。

图1菌株3-Ⅰ生长曲线

图2菌株3-Ⅰ最适生长pH

由图2可以看出，3-Ⅰ菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中生长时，在pH为7和8的条件下，菌株生长速度较快，且菌株3-ⅠpH变化不敏感，说明该菌株可以适应的酸度范围较宽，利于今后野外工程使用。为了更接近北京地区地下水的pH，今后实验选取pH为7时进行。

2.5菌株在人工配水及地下水水样中的脱氮性能研究

分别于接种24h、48h和96h后测定人工配水中硝酸盐含量，结果如图3所示，48h时硝酸盐含量即由223.9 mg/L降为0.6mg/L，72h时硝酸盐含量降为0.1mg/L，去除率高达99.9%，且无亚硝酸盐积累。由于本实验设计时没有定量测定乙酸钠的含量，但从离子色谱图上看出乙酸根的含量在72h时也消耗完毕。在今后的实验中，将进一步优化乙酸钠投入量。

图3菌株3-Ⅰ降解人工配水中的反硝化特性

分别于0h和接种后96h测定菌株3-Ⅰ处理后的W652、HJ121、HJ155水样中的硝酸盐含量，结果如表4所示。通过对这3个水样进行水质分析，发现其中的离子种类和浓度远大于人工配水。3-Ⅰ菌株在96h时对地下水中硝酸盐的去除率均高于99%，可见，3-Ⅰ菌株的脱氮性能基本不受地下水中其它离子的影响。

表4菌株3-Ⅰ分别处理3个地下水水样的脱氮特性数据

3结语

本文依据本单位数年监测数据选取了10个硝酸盐污染的地下水水样，经溴百里酚蓝（BTB）变色培养基初筛及摇瓶培养，从中成功分离筛选出1株高效反硝化细菌，命名为3-Ⅰ。经16S rRNA基因序列分析，其与Rhizobium pusense sp和Beijerinckia fluminensissp的同源性为99%，还需进行生理生化实验及电镜观察形态来进一步确定种属。该菌对pH的耐受范围较大，在pH 5-10的条件下均能良好生长。3-Ⅰ菌株能够以乙酸钠为唯一碳源，硝酸盐及亚硝酸盐为氮源，摇瓶处理72h后在人工配水中硝酸盐去除率高达99.9%，且无亚硝酸积累；在编号为W652、HJ121、HJ155三个地下水中的硝酸盐去除率均高于99%，也无亚硝酸盐积累。菌株3-Ⅰ在硝酸盐人工配水和受硝酸盐污染的北京地下水水样中表现出优异的脱氮性能，具有一定的工程应用价值。

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李丽(1981—)，女，河北石家庄人，北京市水文地质工程地质大队，硕士研究生，助理工程师，主要水资源保护方面的研究工作。