王淑娟 刘文举 王立克 等

摘要：从鹅脑组织中提取总RNA，利用RT-PCR扩增Mel 1c基因cDNA序列。结果表明，Mel 1c基因序列长为1 118 bp；与已报道其他物种的Mel 1c同源性为58.4%～72.2%；氨基酸序列的同源性为74.7%～97.0%；该基因编码的蛋白质为N端在胞内的六次跨膜蛋白，含有信号肽的分泌蛋白，N端亦含有两个糖基化位点；该蛋白也含有G蛋白偶联受体家族的结构域。

关键词：鹅；Mel 1c基因；克隆；生物信息学

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）04-1028-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.053

Cloning of Mel 1c Gene in Goose and Analysis of Bioinformatics

WANG Shu-juan，LIU Wen-ju，WANG Li-ke，PANG Xun-sheng，CHE Chuan-yan

（Colloge of Animal Science，Anhui Science and Technology University， Fengyang 233100， Anhui，China）

Abstract：The total RNA was extracted from the brain of goose and method followed by RT-PCR amplification of the Mel 1c gene. The cloned Mel 1c gene sequence length was 1 118 bp. Comparing to the Mel 1c genes published， the cloned nucleotide fragments showed the highest sequence identity between 58.4% and 72.2%，meanwhile its putative amino acid sequence homology varies from 74.7%～97.0%. The protein may be a cytoplasmic N-termini and six-transmembrane domains. While it may be a signal peptides of the secreted proteins and has two N-linked glycosylated sites. The protein belongs to a superfamily of G-protein coupled receptors.

Key words： goose； Mel 1c gene； clone； bioinformatics

褪黑素（Melatonin，Mel）是由松果体分泌的一种吲哚类激素，其化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxytryptomine）[1]。Mel是一种具有多种功能的光信号，通过其分泌水平的改变，将环境光照周期信息传递给体内有关组织和器官，使其功能活动适应外界的变化。1958年，美国皮肤病专家Lerner等首次从牛的松果体中分离出了褪黑素。此后，褪黑素作为松果体分泌的生物活性最强的物质，其重要性逐渐得到认识，研究也越来越深入。松果体合成释放Mel具有明显的节律性，白昼下呈静止状态，夜晚来临合成增加，人类在夜晚03：00～04：00分泌达到高峰[2]。褪黑素及其受体广泛存在于大脑、下丘脑、中脑、嗅球、视交叉上核等脑区及脊髓和视网膜。近年来，发现在心、肝、脾、肺、肾、胃肠、胸腺、淋巴结、肾上腺、性腺等均存在[3]。褪黑素受体分为Mel 1a、Mel 1b 和Mel 1c等3种亚型[4]。Mel 1a多分布于下丘脑视交叉上核及垂体结节部，其N端含有2个糖基化位点，各种来源的Mel 1a之间氨基酸同源性高达80%以上。Mel 1b基因多在视网膜中表达，其N端含有一个糖基化位点，与Mel 1a之间氨基酸同源性约为60%。与前2种受体相比，Mel 1c C端多了66个氨基酸残基，氨基酸的同源性也在60%左右，跨膜区的同源性可达到77%。而具有明显季节性繁殖特征的动物仅在垂体结节部发现Mel 1a，表明垂体结节部可能是褪黑激素繁殖效应的作用位点[5]。研究表明，Mel 1b基因的表达没有节律性，而Mel 1a和Mel 1c都有节律性表达，两者有很多相似性，如Mel 1c对光的反应和Mel 1a一致，即随着昼夜节律的变化，受体mRNA随之变化，高峰出现在夜晚[6]。目前，对褪黑素的研究主要集中在Mel 1a基因对动物的生殖作用，Mel 1c与Mel 1a基因存在很多相似和不同，所以对Mel 1c基因的研究更有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象 成年母鹅1只，取新鲜脑组织于液氮中保存备用。

1.1.2 主要试剂 RNA提取Trizol试剂（购自Invitrogen公司）、M-MLV RT反转录酶、Taq DNA 聚合酶等（购自Fermentas公司）、dNTP Mix[购自天根生化科技（北京）有限公司]、DNA回收试剂盒[购自生工生物工程（上海）股份有限公司]、pMD18-T载体（购自武汉亚法生物技术公司）。

1.2 方法

1.2.1 脑组织总RNA的提取与反转录 取脑组织约0.1 g，采用Trizol法提取总RNA，溶于40 μL DEPC水中，-80 ℃保存备用。反转录：5 μL总RNA、 0.5 μL Oligo（dT）15 Primer（0.5 μg/μL），70 ℃ 5 min，迅速预冷2 min；然后加入11.75 μL DEPC-H2O、5 μL M-MLV RT 5×Buffer、1.25 μL dNTPs、0.5 μL RNasin Ribonuclease Inhibitor（40 U/μL）和1 μL M-MLV Reverse Transcriptase（200 U/μL），42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min，得到cDNA，置于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 Mel 1c基因的克隆 根据GenBank中鸡和其他动物的Mel 1c基因序列，针对序列保守区域利用Primer5.0软件优化设计2对引物，引物1上游：5′-GGTGCTGAGGAACAAGAAG-3′、引物1下游： 5′-TGCTTTTCAGCCCTTCTG TC-3′；引物2上游： 5′-TTTTAACAGCTGCCTCAATG-3′，引物2下游：5′-AAGGTAAAGGGCAGTTGTTC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物1上游引物靠近5′端，引物2下游引物靠近3′端，然后对两对引物扩增的序列进行拼接即为克隆到的Mel 1c基因部分序列。

以合成的cDNA第一链为模版进行PCR扩增，反应体系为：10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、上游引物（10 μmol/L）0.8 μL、下游引物（10 μmol/L）0.8 μL、2 μL cDNA、0.5 μL Taq酶（5 U/μL），加ddH2O补至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，68/51.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶回收试剂盒回收。

1.2.3 PCR产物的克隆与鉴定 目的片段与pMD18-T载体按照10 μL体系：0.3 μL pMD18-T vector、2.5 μL Solution Ⅰ、7.2 μL回收产物DNA，混合均匀后4 ℃连接过夜。连接产物转化DH5α，用Amp+平板37 ℃培养12 h，挑取单菌落小量培养，然后PCR鉴定重组质粒，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4 分子进化树的构建 将不同物种的氨基酸序列包括测得的鹅序列使用EBI 中的Tools软件ClustalW程序构建分子进化树，对获得的cDNA序列进行Blast同源性分析。

2 结果与分析

2.1 Mel 1c基因的克隆鉴定

对挑取的单菌落进行PCR鉴定，引物1扩增的条带大小为850 bp，引物2扩增的条带为415 bp，片段大小与预期的相一致如图1，引物1和引物2扩增的产物测序结果表明为Mel 1c基因。

2.2 Mel 1c基因核苷酸及其氨基酸序列分析结果

RT-PCR扩增产物测序结果片段分别为850 bp和415 bp，对两段序列进行拼接，得到大小为1 118 bp的片段。Blast比对结果表明，该序列含有Mel 1c基因编码区和非编码区。该编码区与已报道动物的Mel 1c具有较高的同源性。由ExPASy的ProtParamToo软件分析该片段共编码299个氨基酸（图2），分子质量为33 872.4，pI为9.51，且为疏水性蛋白质。Mel 1c蛋白质的二级结构预测显示（图3），α螺旋占很大比例，其次为无规则卷曲、折叠和β转角。此外，预测该蛋白质为分泌蛋白，包含一个信号肽，其剪切位点位于26和27之间（VVA-VY）（图4-1）；与Mel 1a相同的是其N端亦含有两个糖基化位点；而且该蛋白具有G蛋白偶联受体家族1的结构域（1-244），含6个强的跨膜螺旋结构（图4-2）；经亚细胞定位分析预测其可能位于浆膜、高尔基体或内质网。鹅Mel 1c基因部分cDNA序列和氨基酸序列分别与其他已知物种Mel 1c基因cDNA序列与氨基酸序列进行多序列比对（图5、图6）。结果表明，鹅与鮒鱼、斑马鱼、蟾鱼、点篮子鱼、香鱼、鸣禽欧椋鸟、原鸡、狼鲈和点带石斑鱼的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在58.4%～72.2%和74.7%～97.0%之间，和香鱼的核苷酸序列同源性达到72.2%，而与原鸡的氨基酸序列同源性达到97.0%。

2.3 分子进化树

Mel 1c基因中度保守，不同物种间有相同的结构域。分子进化树（图7）表明，Mel 1c基因符合进化规律，斑马鱼是最低等的脊椎动物，而鹅处于分子进化树的最顶层。

3 小结与讨论

研究表明，Mel 1a和Mel 1b基因存在于所有脊椎动物，而Mel 1c基因仅在非哺乳类动物体内存在（如鸟类、禽类、鱼类等）[7]。对哺乳动物体内环境的调节起作用的是Mel 1a；脊椎动物中存在的褪黑素受体Mel 1c与Mel 1a是否有相同的作用还未见报道。本研究克隆了鹅Mel 1c基因的部分cDNA序列，为分离克隆鹅Mel 1c全序列提供了可能。通过Blast分析，发现该扩增序列与鸡的相应区域的氨基酸的同源性为97.0%，并且与其他物种的该基因也有较高的同源性，这说明相似物种同一基因在进化过程中更加保守。Mel 1c蛋白可能为具有独特结构域和功能蛋白的膜蛋白，且Mel 1c为6个跨膜蛋白，而跨膜结构多构成受体、通道，执行信号传导等重要功能[8，9]。Mel 1c受体蛋白为G偶联受体家族1，提示其可能具有G偶联受体家簇1的基本生物学功能，如Mel 1a通过调节cAMP在组织细胞中的浓度来调节动物体的生殖生理作用。

研究表明，褪黑素不仅通过垂体-下丘脑-性腺轴对动物的生殖性能有重要的调节作用，而且也可以直接作用于卵巢。Michelle等[10]研究发现褪黑素对人体黄体化颗粒细胞中的GnRHR、LHR有调节作用，结果表明，GnRH和GnRHR的mRNA水平明显降低，而LHR mRNA水平增加。在禽类中Mel 1c结合褪黑素是否直接作用于卵巢有待进一步研究，克隆Mel 1c基因的功能结构区，并分析其编码产物的基本特性，为深入功能和分子机制研究以及在畜牧生产中的应用奠定了基础，而且为进一步完善褪黑素作用体系有重要的作用。

参考文献：

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