刁毅 刘涛 韩洪波

摘要：为了研究不同地区地木耳（Nostoc commune Vauch.）多糖的结构与体外抗氧化活性，用苯酚-硫酸法测定地木耳多糖含量，用傅里叶变换红外光谱法分析多糖结构，用清除DPPH自由基法、清除超氧阴离子法、清除羟基自由基法测定不同地区地木耳多糖体外抗氧化活性。结果表明，不同地区地木耳多糖含量有差异，蓬溪和名山地木耳多糖含量高于南部地木耳多糖，含量分别为（18.29%±0.21%）和（17.18%±0.17%）。不同地木耳多糖红外光谱峰形、位置相似，但峰强有差异。地木耳多糖对DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基具有较强的清除能力；地木耳多糖抗氧化活性比地木耳提取液强，但比维生素C弱；随着浓度增加，地木耳多糖抗氧化活力增强；蓬溪和名山地木耳多糖抗氧化活性强于南部地木耳多糖抗氧化活性。由此说明，不同地区地木耳多糖含量与其组成有差异，不同地区地木耳多糖抗氧化活性差异大。

关键词：地木耳（Nostoc commune Vauch.）；多糖；傅里叶变换红外光谱；抗氧化活性

中图分类号：S646.6；O657.33；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）04-0984-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.042

Study on FTIR and Antioxidative Activity of Polysaccharides in Nostoc commune

of Different Districts

DIAO Yi， LIU Tao， HAN Hong-bo

（College of Biological and Chemical Engineering Panzhihua University/Sichuan Province Key Laboratory of Characteristic

Biological Resources of Dry and Hot River Valley， Panzhihua 617000， Sichuan， China）

Abstract： In the article， the constitute and antioxidative activities of polysaccharides from Nostoc Commune were studied， and the antioxidative activities of polysaccharides were compared with antioxidative effects of extracts and Vc in order to provide the theoretical basis for application of N. commune. Concents of polysaccharides were determined by phenol-sulfuric acid reaction system. The chemical compositions and configuration of polysaccharides were studied by FTIR spectroscopy. And the antioxidative effects of polysaccharides were investigated by scavenging DPPH free radical， scavenging superoxide radical and scavenging hydroxyl free radical. As a result， contents of polysaccharides in N. commune from Pengxi and Mingshan were higher than from Nanbu. The structures and positions of main characteristic peaks were similar in polysaccharides of three samples， but the strengths of the peaks were different. Polysaccharides could scavenge DPPH free radical， superoxide radical and hydroxyl free radical， antioxidative abilities of polysaccharides were stronger than extracts， but their antioxidative properties were lower than that of Vc. And their antioxidative abilities increased with the increase of concentrations of polysaccharides. And the antioxidative effects of polysaccharides were stronger in N. commune from Pengxi and Mingshan than from Nanbu.

Key words： Nostoc commune Vauch.； polysaccharide； fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）； antioxidative activity

地木耳（Nostoc commune Vauch.）属于蓝藻门（Cyanophyta）念珠藻属（Nostoc）藻类。地木耳在中国分布广泛，营养丰富，具有一定的医疗和保健价值；其中蛋白质含量为14.60%～21.81%，脂类物质含量为0.20%～4.28%，总糖含量为0.53%～23.80%，还含有多种金属元素和丰富的维生素[1，2]。

念珠藻多糖种类多样，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗旱、抗炎症等多种作用，能够显著地增强机体免疫能力，还能促进农作物的生长[3-5]。马文杰等[6]报道地木耳提取液对超氧阴离子自由基和羟基自由基具有清除能力；孙强等[7]报道发状念珠藻多糖具有清除超氧阴离子能力；苗元振等[8]发现真菌多糖具有抗氧化作用；张唐伟等[9]报道地木耳多糖对DPPH自由基和羟基自由基具有较强的清除作用，但对超氧阴离子自由基几乎没有清除效果；汤俊等[10]报道地木耳多糖提取物具有清除超氧阴离子自由基和羟基自由基作用。但不同地区地木耳多糖含量与组成差异、抗氧化作用差异尚未见报道。本试验以不同地区野生地木耳为材料，分离多糖，分析多糖组成，分析不同地区地木耳多糖清除DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基的能力，讨论不同地区地木耳多糖体外抗氧化活性差异，为地木耳的综合应用研究提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用地木耳材料分别采自四川省南部县、名山县和蓬溪县。采集地木耳材料后，洗净泥沙，晾干，贮存备用。

1.2 试剂与仪器

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购于Sigma公司。乙醚、乙醇、抗坏血酸、邻苯三酚、H2O2、FeSO4、氯仿、正丁醇等均为分析纯。

722型分光光度计、索氏提取仪（上海精密科学仪器有限公司）；傅里叶变换红外光谱仪（Thermo公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 地木耳提取液制备 将粉碎的蓬溪、名山和南部地木耳各取2 g，分别置于装有600 mL蒸馏水的1 L锥形瓶中，静置24 h后蒸发浓缩至300 mL，冷却至室温，过滤，将滤液定容至300 mL。

1.3.2 提取地木耳多糖 称取5 g粉碎过筛的干燥地木耳粉末，用乙醚在65 ℃下索氏提取仪中回流1 h进行脱脂。脱脂后，与蒸馏水1∶90混匀，在90 ℃下水浴摇床上浸提6 h，冷冻离心，放入冰箱，重复4次。将水提液在80 ℃水浴锅中浓缩，除去大部分水。将浓缩的水溶性多糖与正丁醇/氯仿混合液（V/V = 5∶2）按1∶1比例混合，振荡20 min，冷冻离心，除去蛋白质，重复3次。水溶性多糖与95%乙醇按照1∶1比例混合，使多糖沉淀析出，用真空抽滤出水溶性多糖[9，11]。在-24 ℃下真空冷冻干燥、称重。采用苯酚-硫酸法测定地木耳中多糖含量。平行测定3次，取其平均值。

1.3.3 地木耳多糖红外光谱检测 取干燥多糖样品0.5 mg与50 mg溴化钾混合在玛瑙钵中研磨均匀并压片，经傅里叶变换红外光谱仪测定[12]，光谱扫描范围4 000～400 cm-1，累计扫描16次，分辨率为4 cm-1。

1.3.4 清除DPPH自由基能力测定 配制不同浓度地木耳提取液和多糖溶液。用无水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，取不同浓度地木耳提取液或多糖溶液2 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL，混匀后室温下暗反应30 min；以2 mL无水乙醇和2 mL蒸馏水混合作为空白对照调零，在517 nm下测定吸光度Ai。以2 mL样品溶液和2 mL无水乙醇混合作为对照，在517 nm下测定吸光度Aj。以2 mL DPPH溶液和2 mL无水乙醇混合作为模型对照组，在517 nm下测定吸光度Ac[13-16]。以同样的方法测定维生素C（VC）的吸光度。平行测定3次，取其平均值。DPPH自由基清除率计算公式如下：

DPPH自由基清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

以清除率为纵坐标，地木耳浓度为横坐标作图，建立回归方程，计算EC50值。

1.3.5 清除超氧阴离子能力测定 配制不同浓度地木耳提取液与多糖溶液。配制pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl溶液，用10 mmol/L HCl配制3 mmol/L邻苯三酚溶液。取50 mmol/L Tris-HCl溶液4.5 mL，蒸馏水4.2 mL，25 ℃下保温20 min，加入25 ℃下预热的3 mmol/L邻苯三酚溶液1 mL，混匀。以10 mmol/L HCl代替3 mmol/L邻苯三酚溶液作为空白调零，在325 nm处每隔30 s测定一次吸光度A，线性范围内每分钟增加的吸光度为A1[13-16]。

取50 mmol/L Tris-HCl溶液4.5 mL，不同浓度地木耳提取液或多糖溶液4.2 mL混匀，其他步骤同上，在325 nm处每隔30 s测定一次吸光度A，线性范围内每分钟增加的吸光度为A2。以同样的方法测定VC的吸光度。平行测定3次，取其平均值。EC50值计算方法同上。超氧阴离子清除率计算公式如下：

超氧阴离子清除率=[（A1-A2）/A1]×100%

1.3.6 清除羟基自由基能力测定 配制不同浓度地木耳提取液与多糖溶液。反应体系中含8.8 mmol/L H2O2、9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L用无水乙醇配制的水杨酸、不同浓度的地木耳提取液或多糖溶液各1 mL，以蒸馏水为参比，最后加入H2O2启动反应，37 ℃下反应30 min，在510 nm处测定各浓度的吸光度Ax。以水为参比代替提取液或多糖，测定对照组吸光度A0。考虑到样品自身的吸光度，以9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水杨酸-乙醇、不同浓度的地木耳提取液与多糖溶液溶液、蒸馏水各1 mL混合测定地木耳提取液与多糖的本底吸收度Ax0[13-16]。用同样的方法测定VC的吸光度。平行测定3次，取平均值，EC50值计算方法同上。羟基自由基清除率计算公式如下：

羟基自由基清除率=[1-（Ax-Ax0）/A0）]×100%

2 结果与分析

2.1 不同地木耳中多糖含量测定

由表1可知，不同地区地木耳中多糖含量有差异，蓬溪和名山地木耳中多糖含量极显著高于南部地木耳多糖含量。

2.2 地木耳多糖红外光谱分析

从图1可以看出3个不同地区地木耳多糖的特征峰值。在3 420 cm-1处有一强吸收峰，该吸收峰主要是由羟基伸缩振动所产生的；在2 920～2 990 cm-1附近出现的吸收峰是糖类C-H的伸缩振动吸收峰；在1 650 cm-1附近的吸收峰主要归属于酰胺基C=O的伸缩振动；在1 400 cm-1附近所出现的一个吸收峰主要是C-H的剪切式振动吸收所产生的；在1 250 cm-1处的吸收峰主要是C-N和N-H伸缩振动；在1 050 cm-1处的吸收峰主要是C-O伸缩振动；在840 cm-1处的吸收峰主要为α-吡喃环C-H变形振动[17，18]。3个不同地区地木耳多糖的红外光谱图峰形与峰位置相似，峰强度有差异，说明不同地区地木耳中多糖类型相似，但多糖含量有较大差异。

2.3 地木耳多糖抗氧化活性的测定

2.3.1 清除DPPH自由基能力的结果分析 由图2可知，随着地木耳多糖和提取液浓度增加，地木耳多糖和提取液对DPPH自由基清除率增加。蓬溪、名山和南部地木耳多糖对DPPH自由基清除作用强于地木耳提取液；蓬溪和名山地木耳多糖对DPPH自由基清除率高于南部地木耳多糖。地木耳提取液在8 g/L时对DPPH清除率达到最大，为（54.64% ± 3.12%）；蓬溪和名山地木耳多糖清除DPPH自由基清除率同样在8 g/L时达到最大，分别为（91.57%± 2.10%）和（87.95%±2.70%）；而南部地木耳多糖在8 g/L时对DPPH自由基清除率为（72.84%±1.60%），比蓬溪和名山地木耳多糖对DPPH清除率低。VC在1 g/L时对DPPH自由基清除率达到（93.78%±1.40）%。蓬溪、名山、南部地木耳多糖对DPPH自由基清除率大于地木耳提取液，但地木耳多糖和地木耳提取液对DPPH自由基清除率均低于VC对DPPH自由基清除率。

2.3.2 清除超氧阴离子能力的结果分析 由图3可知，随浓度增加，地木耳多糖和提取液对超氧阴离子清除率增加。地木耳多糖对超氧阴离子清除作用强于地木耳提取液。蓬溪和名山地木耳多糖对超氧阴离子清除作用强于南部地木耳多糖。地木耳提取液在6.4 g/L时达到最大，为（54.29%±2.12%）。蓬溪和名山地木耳多糖对超氧阴离子清除率在6.4 g/L达到最大，分别为（84.21%±2.50%）和（77.78%±2.66）%；南部地木耳多糖对超氧阴离子清除率在6.4 g/L达到最大，为（69.57%±1.88%），比蓬溪和名山地木耳多糖低。VC在0.1 g/L时，对超氧阴离子清除率达到（97.75%±2.45）%。地木耳多糖对超氧阴离子清除率大于地木耳提取液，地木耳多糖与提取液对超氧阴离子清除率均低于VC。

2.3.3 清除羟基自由基能力的结果分析 由图4可知，随浓度增加，地木耳多糖与提取液对羟基自由基清除作用增加。地木耳多糖对羟基自由基清除作用强于地木耳提取液。蓬溪和名山地木耳多糖对羟基自由基清除作用强于南部地木耳多糖。地木耳提取液在6.4 g/L时达到最大，为（58.32%±1.92%）。蓬溪和名山地木耳多糖对羟基自由基清除率在6.4 g/L达到最大，分别为（88.94%±2.62%）和（84.32%± 2.67%）；南部地木耳多糖对羟基自由基清除率在6.4 g/L时达到最大，为（75.80%±2.24%），比蓬溪和名山地木耳多糖低。VC在0.1 g/L时，对羟基自由基清除率达到（94.69%±1.45%）。地木耳多糖对羟基自由基清除率大于地木耳提取液，地木耳多糖与提取液对羟基自由基清除率均低于VC对羟基自由基清除率。

2.3.4 地木耳多糖抗氧化活性的EC50值测定 由表2可知，地木耳多糖与提取液对DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基清除力的EC50值均较低，说明地木耳提取液和多糖具有较强的抗氧化活性。地木耳提取液对DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基清除率的EC50值最高，南部地木耳多糖清除率的EC50值居中，蓬溪和名山地木耳多糖清除率的EC50值较低，说明蓬溪和名山地木耳多糖抗氧化作用最强，南部地木耳多糖抗氧化作用其次，地木耳提取液抗氧化作用最弱。

3 讨论

生物体内代谢会产生自由基，正常情况下，体内抗氧化系统可清除自由基，但若机体代谢失衡，使机体内自由基过度积累就会造成DNA损伤、蛋白质和酶失活，从而给机体造成伤害，引起炎症、衰老、心血管疾病及肿瘤的发生[8，19-21]。

蓬溪、名山、南部地木耳中多糖含量为16%～19%，比黄晓波等[22]报道的地木耳中多糖含量高；蓬溪和名山地木耳中多糖含量高于南部地木耳。对蓬溪、名山和南部地木耳多糖红外光谱分析发现，3个地区地木耳多糖红外光谱峰形和峰位置相似，但峰强度有差异，说明不同地区地木耳中多糖类型相似，但多糖含量有差异。

张唐伟等[9]报道地木耳多糖对DPPH自由基与羟基自由基具有较强的清除作用，而对超氧阴离子无效果；本研究结果表明，地木耳多糖对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基清除作用强，二者之间有差异。不同地区地木耳多糖对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基清除作用的差异与地木耳多糖的含量、组成与结构有关，这方面还有待进一步研究。

食药用多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂、护肝排毒、促进核酸和蛋白质生物合成等多种生物功能[8]。地木耳多糖抗氧化活性研究有助于地木耳资源的综合利用与开发。

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