胡云云 高同国 张冬冬 等

摘要：对致病菌—尖孢镰刀菌（Fusrium oxysporum）具有较强拮抗作用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）8-32产生的理化性质进行了初步研究。结果表明，该抗菌物质80 ℃处理30 min，拮抗活性仍保持在90.00%，100 ℃以上会完全丧失活性；在pH 7.0～11.0范围内抑菌活性较稳定，最适pH为8.0；高浓度（25 mmol/L）EDTA使其拮抗活性降低62%；该抗菌物质对Cu2+、Fe3+敏感，对蛋白酶K不敏感。枯草芽孢杆菌8-32产生的抗菌物质具有一定的耐热、耐碱（pH 11.0）、对蛋白酶不敏感等特性。

关键词：大豆根腐病； 生物防治； 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）8-32； 抗菌物质； 理化性质

中图分类号：S476+.11 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）04-0917-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.026

A Preliminary Study on Physicochemical Properties of Antibacterial Substances

from Bacillus subtilis 8-32 against Soybean Root Rot

HU Yun-yun1，GAO Tong-guo1，ZHANG Dong-dong1，LI Shu-na1，GUO Xiao-jun1，JIANG Jun-po1，

ZHU Bao-cheng1，WANG Ling-min2

（1.College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China；

2.Mumeihuading Biological Fertilizer Co.， Ltd.，Tangshan 063000，Hebei， China）

Abstract： The physicochemical properties of antibacterial substances secreted by Bacillus subtilis 8-32 which had strong antagonistic against Fusarium oxysporum were studied. The results showed that the antibacterial materials had good heat resistance， antagonist activity remained at 90.00% after 30 min treatment with 80 ℃ and completely lost above 100 ℃；The inhibitory activity of the antibacterial substances was stable in pH 7.0～11.0， and the best pH was 8.0； The antagonist activity reduced by 62% after added 25 mmol/L EDTA； The antibacterial substances were sensitive to Cu2+、Fe3+，but not sensitive to protease K. The experimental results showed that antibacterial substances extracted from B. subtilis 8-32 were heat-resistant， alkali resistant （pH 11.0）， and they were not sensitive to protease K.

Key words： soybean root rot； biological control； Bacillus subtilis 8-32； antagonistic substances； physicochemical properties

大豆是重要的油料作物和粮食作物，近年来由于大豆重茬、迎茬种植比例不断增加，导致大豆根腐病日趋严重，成为制约中国大豆生产的重要病害之一。中国大豆根腐病主要分布于东北和黄淮地区，每年发病面积占大豆播种面积的1/3以上，根腐病造成的产量损失一般在10%～30%，严重的可达50%～60%，甚至绝产，每年造成数亿元的经济损失。因此，大豆根腐病防治技术的研究成为生产中急需解决的问题[1，2]。

大豆根腐病是由多种病原真菌引起的[2]，而尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是大豆根腐病的主要致病菌[3]。目前对大豆根腐病的防治主要依赖于化学农药。近年来，化学农药残毒和对环境的污染问题越来越引起人们的关注，生物防治技术逐渐引起人们的重视[4]。芽孢杆菌具有抗菌谱广、抗辐射、热稳定性好、易生产和储存等特点，在生物防治中表现出很好的发展前景[5，6]。

前期工作中，以病原菌尖孢镰刀菌为指示菌，筛选得到一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）8-32，该菌株对大豆根腐病表现出较强的生防效果。本研究拟进一步对该菌株拮抗物质进行初步分离，并对其理化性质进行研究，以期为进一步应用于大豆根腐病的生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：枯草芽孢杆菌 8-32由河北农业大学生命学院筛选得到；尖孢镰刀菌由中国科学院东北地理与农业生态研究院王光华教授提供。

培养基：①NB培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min；②PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 抗菌物质的初步分离 挑取一环菌种接入NB培养基中，30 ℃，180 r/min条件下振荡培养12 h作为种子液，将种子液以2%接种量转接于NB培养基，相同条件下振荡培养72 h。将发酵液在4 ℃，8 000 r/min离心10 min弃菌体收集上清液备用。

采用硫酸铵分级沉淀法对发酵上清液进行分离，添加硫酸铵饱和度为20%、50%、80%，置于4 ℃冰箱中过夜。4 ℃下10 000 r/min离心30 min，沉淀用无菌水溶解，将收集的粗提液装入透析袋中，透析过夜。将透析液冷冻干燥后，用适量的无菌水溶解，即初步分离到枯草芽胞杆菌8-32拮抗真菌物质。

1.2.2 抗菌物质浓度的测定 采用Bradford检测法进行测定[7]。

1.2.3 抗菌物质活性的测定 挑取直径约为0.6 cm的指示菌菌块，接种于PDA平板中央，25 ℃培养5 d用于活化尖孢镰刀菌。

将约20 mL灭菌PDA培养基倒入培养皿中作为底层培养基。取5 mL无菌水倒入病原菌平板并用接种针刮取孢子制成菌悬液，倒入45 ℃左右的灭菌PDA培养基，混匀铺板，冷却后制成含有病原菌的PDA培养平板。用直径6 mm的打孔器选择合适的间距打孔。然后取80 μL的枯草芽胞杆菌8-32拮抗物质溶液注入小孔内。培养2 d后，测量并记录抑菌圈直径。

1.2.4 抗菌物质理化性质的研究

1）金属离子对拮抗物质抗菌活性的影响。将抗菌物质粗提液分成等体积的若干份，分别加入CaCl2、CuSO4、MnCl2、FeCl3、KCl、NaCl溶液，使金属离子终浓度达到25 mmol/L和50 mmol/L两个水平，同时以无菌水作空白对照，每处理3次重复。

2）EDTA对拮抗物质抗菌作用的影响。在抗菌物质粗提液中分别加入不同终浓度（3.125、6.250、12.500、25.000 mmol/L）的EDTA溶液，同样以无菌水作为空白对照，每处理3次重复。

3）pH对菌株拮抗物质活性的影响。在上述抗菌物质粗提液中分别加入0.05 mol/L pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液。pH 3.0～8.0采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH 9.0～11.0采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，以无菌水为对照，每处理3次重复。

4）热处理对菌株拮抗物质活性的影响。将上述抗菌粗溶液经40、60、80、100、121 ℃处理30 min，测定热处理后拮抗物质抑菌活性的变化，以未经热处理的拮抗物质作为对照，每处理3次重复。

5）抗菌物质对蛋白酶的稳定性。向抗菌物质溶液中加入蛋白酶K溶液，使蛋白酶终浓度为1 mg/mL。盖紧离心管，反应混合物在37 ℃孵育2 h后将其放入80 ℃的水浴锅内，维持10 min以使酶失活终止反应。以未经蛋白酶处理的等浓度的拮抗物质作为对照，每处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 抗菌物质含量的测定结果

以牛血清白蛋白为标准品测定蛋白质浓度，标准曲线见图1。由图1可知，R2=0.990 8，线性相关性较好，曲线方程为y=0.004 6x+0.009 5，可作为蛋白质浓度测定的标准曲线。

用考马斯亮蓝G250测定了饱和度为20%、50%和80%的硫酸铵析出的拮抗物质的浓度，其浓度分别为0.742、6.399、11.060 μg/μL。

2.2 抗菌物质的抑菌试验

采用饱和度为20%、50%和80%的硫酸铵盐析抗菌粗提物，抑菌试验结果如图2所示。由图2可知，枯草芽胞杆菌8-32菌株发酵液经饱和度为50%硫酸铵盐析后的沉淀物抑菌活性最高，对其进行理化性质的研究。

2.3 抗菌物质的理化性质测定结果

2.3.1 金属离子对拮抗物质抗菌活性的影响 金属离子对拮抗物质抗菌活性的影响试验结果如图3。由图3可以看出，不同金属离子对枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质的活性具有不同影响。枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质经25 mmol/L的Ca2+、Mn2+、K+、Na+处理后，抑菌活性分别维持在对照品的100.00%、86.21%、82.76%、100.00%。经50 mmol/L的Ca2+、Mn2+、K+、Na+处理后，抑菌活性分别维持在对照品的93.93%、81.82%、96.97%、103.03%。经25 mmol/L的Cu2+、Fe3+处理后，活性维持在对照品的20.69%、6.96%。50 mmol/L的Cu2+处理后枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质活性维持在对照品的6.06%，50 mmol/L的Fe3+处理后抑菌活性完全丧失。

2.3.2 EDTA对拮抗物质抗菌活性的影响 EDTA对拮抗物质抗菌活性的影响见图4。由图4可以看出，不同浓度的EDTA溶液对枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质的活性具有不同影响，浓度为3.125、6.250、12.500 mmoL/L的EDTA使枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质的活性稍微有些降低，分别为对照品的80.13%、70.51%和80.13%。而经25.000 mmoL/L EDTA处理后抗菌物质活性明显降低，为对照品的38.46%。可见较高浓度的EDTA溶液可降低枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质的活性。

2.3.3 酸碱度对菌株拮抗物质抗菌活性的影响 枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质对pH的稳定性试验结果见图5。由图5可以看出，枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质在pH 7.0～11.0范围内活性变化不大，pH 7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的缓冲液分别处理后，拮抗物质活性分别为对照品的96.15%、100.00%、92.30%、88.46%、80.77%。但当pH降至6.0时，拮抗物质活性开始迅速减弱，为对照品的73.07%，pH 3.0时抑菌活性完全丧失。由此可知枯草芽孢杆菌8-32抗菌物质具有较强的耐碱性（pH 11.0），其最适pH为8.0。

2.3.4 热处理对菌株抗菌物质活性的影响 温度对抗菌物质活性的影响见图6。由图6可以看出，温度不高于60 ℃时，对拮抗物质活性没有影响，当温度达到80 ℃时拮抗物质的活性开始略微下降，分别经40、60、80 ℃处理30 min后拮抗物质的抑菌活性为对照品的100.00%、100.00%、90.00%。当经100 ℃和121 ℃分别处理30 min后，拮抗物质的抑菌活性完全丧失。可知枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质具有一定的耐热性。

2.3.5 蛋白酶对菌株拮抗物质活性的影响 抗菌活性物质对蛋白酶的稳定性结果见图7。从图7可以看出，蛋白酶K对枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质的活性没有显著影响，拮抗物质经1 mg/mL的蛋白酶K经37 ℃处理2 h后，其抑菌活性为等浓度拮抗物质的92.86%。可知枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质对蛋白酶K不敏感。

3 小结与讨论

本研究对尖孢镰刀菌拮抗菌株枯草芽孢杆菌8-32进行了抗菌物质的提取，活性检测发现饱和度为50%的硫酸铵析出的拮抗物质活性最佳，并对其进行了理化性质的研究。该物质对温度有一定的稳定性，温度不高于80 ℃时，对拮抗物质活性几乎没有影响，当温度高于100 ℃时，拮抗物质活性完全丧失；对蛋白酶K不敏感。

对枯草芽孢杆菌8-32拮抗物质的上述研究表明，大豆根腐病拮抗菌枯草芽孢杆菌8-32抗菌物质具有一定的耐热、耐碱（pH 11.0）、对蛋白酶K不敏感等特性，具有进一步研究的价值。

参考文献：

[1] 王 佳.大豆根腐病生防菌的鉴定及发酵条件的优化[D].哈尔滨：黑龙江大学，2010.

[2] 许艳丽，战丽莉，李春杰，等.大豆病害发生特点和综合防治技术[J].大豆科技，2009（3）：15-17.

[3] 台莲梅.大豆根腐病菌（Fusarium oxysporum）毒素及其对大豆根部致病作用的研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2003.

[4] WHIPPS J M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere[J].Journal of Experimental Botany，2001，52：487-511.

[5] EMMERT E A B，HANDELSMAN J. Biocontrol of plant disease： A （Gram-）positive perspective[J]. FEMS Microbiology Letters，1999，171（1）：1-9.

[6] FRAVEL D，OLIVAIN C，ALABOUVETTEl C. Fusarium oxysporum and its biocontrol[J].New Phytologist，2003，157：493-502.

[7] BRADFORD M M. Arapid and sensitive method for the quantity of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.