乔铁+梁可+马进+林蔗茹+郑冰元+张立德

[摘要]探讨黄芪皂苷对化疗贫血小鼠PI3K/Akt/mTOR相关基因mRNA表达的影响。选取6～7周龄BALB/c小鼠48只，雄性，随机分为空白组、模型组、皂苷组、甲苷组，每组12只。采用环磷酰胺建立化疗贫血模型，灌胃治疗14 d后，摘眼球取血，QPCR法检测脾脏中Akt，PI3K，BCL-xl，bad，FoxO，mTOR，PTEN的mRNA水平。结果表明，模型组血红细胞计数，血红蛋白含量与空白组、皂苷组和甲苷组比较，明显降低（P<0.05）。与空白组、皂苷组、甲苷组相比，模型组Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR水平明显降低（P<0.05或P<0.01）；皂苷组这5种基因水平均较空白组无明显差别；除PI3K外的4种基因，甲苷组较空白组有明显差别（P<0.05或P<0.01）；而皂苷组与甲苷组水平也有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。模型组与空白组、皂苷组相比，FoxO，PTEN水平明显升高（P<0.05或P<0.01），较甲苷组无明显差异；甲苷组这2种基因水平均较空白组升高显著（P<0.05）；而皂苷组的FoxO高于空白组（P<0.05），皂苷组的PTEN与空白组无明显差异；皂苷组FoxO，PTEN水平与甲苷组无统计学意义。因此，该研究结果显示黄芪皂苷能提高Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR水平（P<0.01），降低 FoxO，PTEN水平（P<0.05）。黄芪皂苷可有效改善环磷酰胺所造成的贫血，其机制可能与影响PI3K/Akt/mTOR信号通路相关基因有关。

[关键词]黄芪； PI3K/Akt/mTOR； mRNA； 化疗贫血

[Abstract]To study the influence of astragaloside on mRNA expression of PI3K/Akt/mTOR signal transduction in anemia model mice induced by chemotherapy， 48 male BALB/c mice which were 6-7 week old were picked as the research objects and randomly divided into four groups， blank group， model group， astragaloside group and astragaloside IV group. Each group was 12 mice. Chemotherapy anemia model was established by cyclophosphamide. The mice were drawn blood from eyeball after 14 days treatment. The QPCR was used to test the mRNA concentrations of Akt， PI3K， BCL-xl， bad， FoxO， mTOR， PTEN in mouse spleen. In comparison of blank group， astragaloside group and astragaloside IV group，the erythrocyte counting and values of Hb in model group were significantly lower （P<0.05）. The volumes mRNA of Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR were lower in blank group， compared with other groups （P<0.05 or P<0.01）. The similar trend in astragaloside IV group except PI3K， comparing with blank group （P<0.05 or P<0.01）. The contents of these five genes were no significant differentiations between astragaloside group and blank group. The statistics were obvious between astragaloside group and astragaloside IV group （P<0.05 or P<0.01）. The concentrations of FoxO， PTEN were higher in model group，compared with blank group and astragaloside group （P<0.05 or P<0.01）， but no difference with astragaloside IV group. Comparing with blank group， the volumes of these two genes were increased in astragaloside IV group （P<0.05）， FoxO was higher in astragaloside group （P<0.05）， but PTEN was not significant. There was no the same as astragaloside group and Astragaloside IV group. Therefore， astragaloside could increase the contents of Akt， PI3K， BCL-xl， bad， mTOR （P<0.01）， decrease the concentrations of FoxO， PTEN （P<0.05）. The changes in cyclophosphamide-induced anemia were highly significant by astragaloside. It could be related to the mRNA expression of PI3K/Akt/mTOR Signal Transduction.

[Key words]astragaloside； PI3K/Akt/mTOR； mRNA； chemotherapy-induced anemia

doi：10.4268/cjcmm20162019

黄芪是中医临床上常用的一味中药，具有健脾补中、升阳举陷、益卫固表、利尿、托毒生肌等多种功效^[1-2]。其实早在《日华子本草》明确指出黄芪具有“补血”作用，《本草纲目》谓黄芪“可治一切气衰血虚之症”。现代药理研究表明，黄芪的主要活性成分黄芪皂苷具有促进小鼠骨髓造血干细胞增殖的作用^[3-6]。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K/Akt/mTOR）信号通路在维持造血系统稳态和造血细胞定向分化中起着重要的作用，PI3K/Akt/mTOR信号通路的异常激活或者失活都会破坏造血系统平衡，严重的影响造血机能^[7-8]。本文旨在探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在黄芪皂苷对化疗贫血模型小鼠发挥“补血”作用的机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级BALB/c小鼠48只，雄性，6～7周龄，购自北京维通利华有限公司，许可证号SCXK（京） 2010-0002。

1.2 药物与试剂 黄芪皂苷（astragaloside，成都曼斯特生物科技有限公司， 纯度≥98%，批号MUST-13100901）；黄芪甲苷（中国食品药品检定研究院，批号110781-201314）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara公司）；Brilliant Ⅲ Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix（Agilent Technologies公司）。

1.3 仪器 HEMAVET950FS型全自动五分类多物种血液分析仪（美国Drew公司）；荧光定量PCR仪（Stratagene Mx3000P，德国安捷伦公司）；蛋白核酸分析仪（DU640，美国贝克曼公司）；低温高速离心机（MR1822，法国Jouan SA公司）。

2 方法

2.1 造模与分组 48只雄性BALB/c小鼠，按外周血红细胞计数随机分为空白组、模型组、皂苷组、甲苷组，每组12只。空白组：正常饲养，不予特殊处理。模型组、皂苷组和甲苷组分别于第1，3，5天按0.2 g·kg^-1体重剂量腹腔注射环磷酰胺。于造模第7天灌胃给药，空白组、模型组均按10 g·kg^-1体重胃饲1 mL蒸馏水；皂苷组按10 g·kg^-1体重胃饲1 mL黄芪皂苷悬液；甲苷组按10 g·kg^-1体重胃饲1 mL黄芪甲苷混悬液，连续灌胃14 d。于末次给药后24 h，摘眼球取血，脱颈处死小鼠，立即解剖，摘取脾脏，去除其他脂肪组织，置于0.9%氯化钠溶液中漂去血液，用滤纸吸干，并用锡纸包裹，放置-70 ℃ 冰箱冷冻保存。

2.2 外周血红细胞计数、血红蛋白含量的检测 于末次给药后24 h，摘眼球取血，置于抗凝管中，然后放置在涡旋混合机上，充分震荡使血液与抗凝剂混匀，防止血液凝固，再用全自动五分类多物种血液分析仪检测。

2.3 总RNA的提取和反转录 取50～100 mg脾组织，放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，反复3次后，加入1 mL Trizol，转移入离心管中。将样品室温放置5 min，离心10 min，取上清，加入200 μL氯仿；加盖，剧烈震荡15 s，室温放置5 min，离心15 min，使溶液分为3相；取无色上层水相400 μL，加入500 μL异丙醇；加盖，上下颠倒10次混匀，室温放置10 min后，离心10 min，弃上清，加入75%乙醇1 mL，吹打洗涤沉淀，离心5 min；弃上清，空气干燥至乙醇全部挥发；加入无RNA酶水30 μL溶解RNA，取4 μL RNA样品稀释25倍，使用核酸蛋白分析仪检测吸光度，记录A₂₆₀和A₂₆₀/A₂₈₀；计算RNA浓度。

使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒。①基因组DNA的去除反应：0.5 μg总RNA加入5×g DNA Eraser Buffer 2 μL，g DNA Eraser 1 μL，加无核酸酶水至10 μL；反应条件为42 ℃ 2 min。②反转录反应：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase Free H₂O 4 μL加入步骤①的反应液10 μL；反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。产物cDNA 4 ℃保存备用。

2.4 引物 应用Invitrogen公司在线引物设计软件OligoPerpectTM Desiner设计，采用BLAST进行比对，由Invitrogen公司合成。设计的引物相关情况见表1。

2.5 QPCR检测 mRNA表达的方法 总RNA提取采用Trizol方法，按试剂盒说明书操作，核酸蛋白分析仪检测总RNA的A₂₆₀和A₂₆₀/A₂₈₀，计算浓度。cRNA合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒10 μL。在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后对未知模板进行相对定量分析。各基因实时定量PCR扩增产物的鉴定利用熔解曲线分析法：各基因完成PCR扩增循环后进行产物熔解曲线分析，以确定产物纯度。熔解曲线收集条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min后采集荧光信号，重复40个循环；在循环反应后，按以下条件测溶解曲线：95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。在55 ℃升温至95 ℃过程中，每升高0.5 ℃采集一次荧光信号。先以梯度稀释的cDNA模板，测得各引物的扩增效率。再以各组样品进行定量PCR检测，反应结束后，由溶解曲线判断PCR反应的特异性。

2.6 统计学方法 根据Ratio=（1+E_target）^{ΔCttarget（control-sample）}/（1+E_ref）^{ΔCtref（control-sample）}公式，计算出各样品mRNA的相对表达量，其中E_target为目的基因的扩增效率，E_ref为内参基因的扩增效率，ΔCt为对照组Ct值与样品Ct值的差。实验数据用±s，用SPSS 17.0软件进行统计。组间比较用方差齐性检验，方差分析用One-Way ANOVA程序分析。P<0.05表示有统计学意义。

3 结果

3.1 对化疗贫血小鼠血红细胞计数与血红蛋白含量的影响 与空白组比较，模型组血红细胞计数和血红蛋白含量明显降低（P<0.05），与模型组比较，皂苷组和甲苷组血红细胞计数和血红蛋白含量明显升高（P<0.05），皂苷组的血红细胞计数和血红蛋白含量无明显差异，见表2。

3.2 对化疗贫血小鼠Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR mRNA水平的影响 与空白组、皂苷组、甲苷组相比，模型组Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR水平明显降低（P<0.05或P<0.01）；皂苷组这5种基因水平均较空白组无明显差别；除PI3K外的4种基因，甲苷组较空白组有明显差别（P<0.05或P<0.01）；而皂苷组与甲苷组水平也有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表3。

3.3 对化疗贫血小鼠FoxO，PTEN mRNA水平的影响 模型组与空白组、皂苷组相比，FoxO，PTEN水平明显升高（P<0.05或P<0.01），较甲苷组无明显差异；甲苷组这2种基因水平均较空白组升高显著（P<0.05）；而皂苷组的FoxO高于空白组（P<0.05），皂苷组的PTEN与空白组无明显差异；皂苷组FoxO，PTEN水平与甲苷组无统计学意义，见表4。

4 讨论

PI3K/Akt/mTOR信号通路参与许多重要生物学过程的调控，它在调节细胞生长和生存中起着关键性的作用。此通路中的关键节点包括PI3K，Akt，mTOR，PTEN，Bad，Bcl-xl，FoxO等。PI3K是PI3K/Akt/mTOR信号通路的重要上游始动分子，关系着细胞生长、增殖和存活等许多方面，在造血干细胞的自我更新和分化中扮演着重要的角色。Akt是PI3K/Akt/mTOR信号通路中承上启下的枢纽，激活的Akt能使底物的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化而起到抗凋亡和保护细胞的作用，调控B细胞的成熟和存活，抑制细胞凋亡。mTOR在细胞的生长和增殖中起着关键作用，mTORC1的异常激活会导致造血干细胞快速增殖并最终耗竭失去造血重建的能力。负调控蛋白 PTEN 缺失引起的PI3K异常激活会引起造血干细胞的耗竭和B细胞发育的阻滞。Bcl-xl是主要的抗凋亡分子，而Bad起着促进细胞凋亡的作用。两者表达的平衡对细胞是否发生凋亡起着重要的调节作用。FoxO的缺失会导致造血干细胞造血重建失败。PI3K/Akt/mTOR通路与干细胞的造血和免疫功能有关，广泛参与了干细胞生长、增殖、凋亡等过程。因此，有效抑制PI3K信号通路能够有效扩增造血干细胞，提高机体免疫，在开发造血系统疾病药物方面有广泛前景^[9-14]。

研究表明，模型组与空白组在Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR的mRNA水平存在明显差异（P<0.01），说明模型组小鼠受到化疗药物环磷酰胺的影响，导致机体造血功能下降。空白组与皂苷组比较，在这5种基因水平上，无明显差异，说明化疗贫血小鼠经黄芪皂苷后，其造血功能基本恢复。而空白组与甲苷组比较后发现，除PI3K外，其余基因甲苷组均较空白组有显著性差异（P<0.05或P<0.01），表明单纯给予黄芪甲苷不能完全恢复这5种基因的水平。同时，本研究还发现，皂苷组与甲苷组在这5种基因水平上也存在明显差异。有研究表明，黄芪皂苷中的化学成分除黄芪甲苷外，还存在黄芪皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，异黄芪皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及大豆皂苷Ⅰ等40多种皂苷类成分^[15]，分析可能是由于多种成分的相互作用，使得黄芪皂苷在改善机体造血功能，提高免疫方面强于单一成分黄芪甲苷。

本研究中，对于FoxO和PTEN 2个基因，空白组和模型组有显著性差异（P<0.01），表明造模成功。皂苷组与模型组比较，有统计学意义（P<0.05），而甲苷组与模型组比较，无显著性差异，表明皂苷组作用于化疗贫血模型FoxO，PTEN的mRNA水平更强。空白组与甲苷组、皂苷组的对比，也说明这一特点。空白组与甲苷组有明显差异（P<0.05），与皂苷组的FoxO有差异（P<0.05），但与皂苷组的PTEN无明显差异。试分析黄芪皂苷在改善由于化疗引起的造血功能异常方面作用优于黄芪甲苷，除了黄芪皂苷多种成分的相互作用，还可能是黄芪皂苷的多种成分，更利于体内的吸收。因此，黄芪皂苷能够作用于FoxO和PTEN 2个基因，改善化疗贫血症状。

黄芪皂苷介导PI3K/Akt/mTOR信号通路，能够改善化疗药引起的贫血症状，提高机体造血功能，从而增强免疫机能。同时本实验还研究了PI3K/Akt/mTOR通路中与细胞凋亡有关的BCL-xl，bad基因，与造血干细胞造血重建有关的FoxO基因和与造血干细胞、B细胞发育有关的PTEN基因，表明黄芪皂苷影响造血干细胞的发育，重建和凋亡等过程，进而改善机体造血和免疫功能。因此，黄芪皂苷可以应用于肿瘤化疗，在降低化疗药物的毒副作用具有重要意义，同时本研究也为中药在治疗肿瘤减毒增效方面，提供新思路。

[参考文献]

[1]中国药典. 一部[S]. 2010：283.

[2]钟赣生. 中药学[M]. 北京：中国中医药出版社，2012：371.

[3]李新，范颖. 多指标正交试验分析黄芪补血有效部位的交互关系[J]. 世界科学技术——中医药现代化，2013，15（1）：73.

[4]万春平. 黄芪皂苷Ⅲ通过IFN-γ介导体外免疫调节作用的研究[J]. 云南中医中药杂志，2011， 32（9）：69.

[5]陈国辉，黄文冈. 黄芪的化学成分及药理作用研究进展[J]. 中国新药杂志，2008，17（17）：1480.

[6]翁玲，刘学英， 刘彦，等. 黄芪多糖对小鼠骨髓及外周血造血干细胞的增殖及动员作用[J].基础与临床，2003，23（3）：306.

[7]Chi Zhenming， Liu Zirong. Inositaol-mediated invertase secretion in Saccharomyces sp. W₄[J]. Enzyme Microb Tech， 1997，21（6）：463.

[8]张英驰，程涛，袁卫平. PI3K/Akt/mTOR信号通路在造血干细胞中作用的研究进展[J]. 中国实验血液学杂志，2013， 2（1）：245.

[9]Weissman I L， Shizuru J A. The origins of the identification and isolation of hematotoietic stem cells， and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases[J]. Blood，2008，112（9）：3543.

[10]许国顺，孟爱民. mTOR信号通路对造血干细胞调控作用研究进展[J]. 中国药理学通报，2013， 29（9）：1185.

[11]李玉娟，柳垂亮，王飞，等. 异氟醚和七氟醚对新生大鼠皮质凋亡以及Akt和Bcl-xl/Bad表达的不同影响[J]. 中山大学学报，2011，32（3）：291.

[12]张静，马翠丽，王志国. 黄芪甲苷对大鼠心肌局部缺血再灌注损伤的改善作用及其对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响[J]. 吉林大学学报：医学版，2014，40（5）：991.

[13]刘宇佳，楼斯悦，田晨，等. 低氧激活自噬促进人间充质干细胞成骨分化的研究[J]. 中国现代应用药学，2016，33（3）：284.

[14]程明秀，赵宗江，章燕棋，等. 补肾益髓生血法AA大鼠含药血清对BMSCs与BMNCs共培养BMNCs增殖分化及SDF-1/CXCR4/PI3K/AKT信号通路的影响[J]. 中华中医药杂志，2015，30（8）：2877.

[15]张霞. 黄芪化学成分及药理作用概述[J]. 实用中医药杂志，2013， 29（7）：68.

[责任编辑 马超一]