张维谊 王晓旭 沈莉萍 徐 锋 宁 昆 齐新永

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

2015年上海地区猪链球菌的检测与分析

张维谊 王晓旭 沈莉萍 徐 锋 宁 昆 齐新永

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

对2015年上海地区猪屠宰场、猪养殖场、临床病死猪开展猪链球菌的分离检测，主要包括对猪唾液、猪鼻拭子、猪场空气样本、扁桃体、肺脏等共363份进行细菌分离和PCR鉴定，共分离到猪链球菌43株，对这43株细菌开展mrp、orf2、s1y、gdh、gapdh、epf、fbps 7种主要毒力因子检测，通过对病原的分析，了解上海地区猪链球菌病的疫情动态和趋势，为防控猪链球菌病提供依据。

猪链球菌；检测；分型；毒力因子

猪链球菌（Streptococcus suis）是革兰氏阳性球菌，属于链球菌属马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp. equi），主要存在于猪扁桃体和鼻腔中，也存在于生殖道和消化道中，属国家规定的二类动物疫病，也是一种重要的人畜共患病原菌。猪链球菌在全世界范围内广泛存在，并且严重影响各国养猪业的发展。猪链球菌根据其多糖荚膜的抗原性差异，目前已发现有35个血清型（l～34型和1/2型）（陈经雕，2008）［1］，主要的毒力因子有谷氨酸脱氢酶（gdh）、溶菌酶释放蛋白（mrp）、胞外因子（epf）、溶血素（sly）、纤连蛋白结合蛋白/纤连蛋白（fpbs）、毒力相关序列（orf2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

本研究采用传统的细菌分离培养与分子生物学PCR结合的鉴定技术，对上海地区养殖场、屠宰场和临床门诊开展猪链球菌病的流行情况调查，并对病原进行血清型分型和毒力因子检测，旨在摸清上海地区猪链球菌病的疫情动态和趋势，为防控猪链球菌病提供依据。

1 材料

1.1 样本

来自2015年上海地区猪养殖场、猪屠宰场和本中心畜禽临床样本，主要包括养殖场中小猪唾液样本、猪鼻拭子样本、环境样本，生猪屠宰场肺脏、扁桃体和下颌淋巴结样本以及门诊中病/死猪内脏样本。

1.2 主要试剂和仪器设备

1.2.1 培养基、诊断试剂

Columbia血琼脂基础，脱纤维羊血购自闵行区诸翟无菌动物血试剂供应站，革兰氏阳性细菌鉴定卡（GP）、引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，Premix购自TaKaRa公司。

1.2.2 标准菌株

猪链球菌标准株SS2 由德国吉森大学Baljer 教授惠赠。

1.2.3 仪器

全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）、普通PCR仪（BioRad PTC-200）。

2 方法

2.1 样本采集和处理

2.1.1 小猪唾液样本：将灭菌棉绳捆绑在食槽，待小猪咬食棉绳10分钟后，将棉绳中唾液拧至采样袋。共采集2家猪场猪唾液样品，36份样品。吸取100ul唾液涂于培养基培养。

2.1.2 环境样本：用空气浮游菌采样器对猪场空气进行样品采集，空气流量设为100cm3/S，采集3s，每栋猪舍采集2份标本，共计32份样品。对样本直接进行培养。

2.1.3 养殖场中猪鼻拭子样本：用灭菌棉签，伸入猪鼻腔内深处，旋转2圈，采集猪鼻拭样本。每季度采集2个区，每次2个猪场，每个场10份鼻拭。直接涂于培养基培养。

2.1.4 屠宰场内脏样本：无菌采集猪屠宰场肺脏、扁桃体和下颌淋巴结样本于样品袋内。上下半年分4次采集3个猪屠宰场的140份样品进行猪链球菌分离。上半年肺脏、扁桃体和下颌淋巴结各20份，下半年采集肺脏、扁桃体各30份。用灭菌生理盐水冲洗扁桃体和肺脏组织，无菌采取扁桃体和肺脏组织涂抹接种培养基培养。

2.1.5 病/死猪内脏样本：无菌采集死亡猪的肝、脾、肺、心、淋巴结、扁桃体等组织，脑膜炎病例还采集脑组织等样品；对局部感染病例，无菌采集关节液及其周围组织或局部脓液。

2.2 细菌分离培养

按要求将样本涂抹接种于Columbia血平板（加入1μl/ml过滤除菌的NAD和5～10%脱纤维绵羊血），在5%CO2培养箱中经36℃培养24～48h，对可疑菌落进行革兰氏染色镜检。挑取单个菌落接种于Columbia血平板进行纯培养，观察菌落特征，染色特点。

2.3 细菌鉴定

参照文献［2］合成猪链球菌的引物，具体见表1。PCR反应体系为25μl：premix 12.5μl，引物各0.5μl，ddH2O 8.5μl，模板2μl。反应条件为：94℃预热5 min；94℃30s，56℃30s，72℃1 min，扩增30个循环；72℃延伸10 min。

表1 猪链球菌二重PCR检测引物

2.4 猪链球菌主要毒力因子检测

参照李小军等［2］建立的两组多重PCR方法检测mrp、orf2、sly、gdh、gapdh、epf、fbps 7种主要毒力因子。具体方法见参考文献。

3 结果

3.1 细菌分离鉴定

经24h培养，对α溶血、灰白色、湿润、表面光滑、边缘整齐、1mm大小菌落染色镜检，G+球菌，2～5个链，经Columbia血平板24h纯培养，菌落提取DNA模板，进行猪链球菌二重PCR检测，共43份阳性。对猪链球菌PCR阳性菌株在VITEK2-Compact和VITEK MS上进行鉴定，均为猪链球菌属。

3.2 分离检测结果

2015年从363样本中共分离到57株猪源致病性链球菌，其中共鉴定出猪链球菌43株，总阳性率为11.85%，具体见如下数据：

从36份猪唾液样本分离到到6株，分离率为16.67%；从80份猪鼻拭中分离到16份猪链球菌，分离率为20%；从140份屠宰场内脏样本中分离出猪链球菌7株，分离率为8.75%，均来自上半年扁桃体内脏，未从其他组织分离到猪链球菌；32份空气样品未检测到猪链球菌。

2015年从75份临床病例中分离到14例猪链球菌病临床病例，从猪发病表现来看，临床上关节炎型、败血症型、脑膜炎型分别占35.7%、28.6%、21.4%；14例猪链球菌病临床病例多以混合感染为主，单纯链球菌感染病例很少见（2，14.29%）。临床常见的病例伪狂犬+猪链球菌（3，21.43%）猪蓝耳病+猪链球菌（3，21.43%）。

3.3 猪链球菌主要毒力因子检测结果

gdh、gapdhgdh、orf2 3种毒力因子大部分菌株都能检出，gdh、gapdh这2种毒力因子的检测率最高，达95.34%，orf2的检出率其次，70.07%，50%菌株能检出mrp、fbps，但epf、sly检查率低，分别为39.53%、25.58%。

4 分析

自20世纪50年代初期证实猪链球菌是猪脑膜脑炎、关节炎的主要病原以来，荷兰、英国、美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、巴西、丹麦、日本、中国（包括台湾省）等先后报道了猪链球菌病。1998年-1999年夏季在我国江苏省部分地区猪群中暴发流行并导致特定人群感染致死的也是猪链球菌，2005年又在四川爆发生猪因感染链球菌发病死亡的案例，可见猪链球菌不仅多畜牧业造成巨大危害，也对人类公共卫生安全产生了严重威胁。本研究选择猪链球菌有重要意义，从检查结果看阳性率达11.85%，要重视猪链球菌病的防控。

猪链球菌的天然定植部位是上呼吸道，尤其扁桃体和鼻腔中，在本研究中分离率最高的是从猪养殖场的80份猪鼻拭中分离到16份猪链球菌，分离率为20%；而从140份屠宰场的扁桃体中分离出猪链球菌7株，分离率为8.75%，扁桃体分离率低于猪鼻拭的分离率。此外，在养殖场的空气样品未检测到猪链球菌，这可能间接证明空气中未含有猪链球菌。

猪链球菌培养条件要求严格，在室温下仅少量存活，专门需要在体内环境中生长［3］，体外存活时间短，采集的样品需要在没有使用抗生素之前。目前没有找到添加何种抗生素进行猪链球菌增菌，直接进行平板培养，如果采集的样品污染严重，分离更加困难，今后需加强对猪链球菌增菌培养的研究。

研究表明，猪链球菌致病性强弱与其毒力因子密切相关。其中mrp和epf是强毒株的标志，sly为一种巯基活化类毒素，在菌体入侵和裂解细胞的过程发挥作用。其他独立因子均与细菌的致病性有着密切的关系。研究中有50%菌株检出mrp，39.53%的菌株检出epf，说明有近4成的猪链球菌为强度株。

［1］ 李小军.上海地区猪链球菌致病性血清型及其毒力因子的流行病学调查［D］.南京农业大学，2007.

［2］ 赵德明，张仲秋，周向梅.猪病学［M］.北京：中国农业大学出版社，2014：800-801.

［3］ 李鹏，何永聚，冯书章.猪链球菌2型新毒力相关基因的研究进展［J］.中国生物制品学杂志，2011，24（3）：362-365.

张维谊（1979—），女，硕士，高级兽医师，一直从事动物疫病的检测、监测、诊断和技术推广工作。

研究来源：沪农青字（2014）第2-12 号和沪农科攻字（2014）第7-3-3号